Summary
Новый вид клеточный белок прион (PrP
Abstract
Центральным событием в патогенезе прионных заболеваний включает в себя преобразование хоста в кодировке сотовой прионных белков PrP C в своей патогенной изоформы PrP Sc 1. PrP C является моющим средством растворимых и чувствительны к протеиназы К (PK)-пищеварения, в то время как PrPSc, образует нерастворимые моющих средств агрегатов и частично устойчивы к ПК 2-6. Преобразование PrP C в PrPSc, как известно, связаны с конформационного перехода из α-спиральные к β-лист структуре белка. Тем не менее, в пути естественных условиях все еще плохо изучены. Предварительный эндогенных PrPSc, промежуточные PrP * или "тихая прионных", до сих пор не определены в неинфицированных мозга 7.
Использование комбинации биофизических и биохимических подходов, мы определили нерастворимые PrP C агрегатов (назначенный IPRP C) из неинфицированных млекопитающих мозг и культурный нейроновклетки 8, 9. Здесь мы описываем подробные процедуры из этих методов, в том числе ультрацентрифугирования в моющих буфер, сахарозу шаг градиента осаждение, хроматография исключения, IPRP обогащения гена 5 белков (G5p), которые специфически связываются с структурно изменило PrP формы 10 и ПК-лечение. Сочетание этих подходов изолирует не только нерастворимые PrPSc, и PrP C агрегатов, но и растворимого PrP C олигомеров от нормального человеческого мозга. Так как протоколы, описанные здесь, были использованы для выделения и PrPSc, от инфицированной мозги и IPRP C от неинфицированных мозги, они дают нам возможность сравнить различия в физико-химическими свойствами, нейротоксичность, и инфекционной двух изоформ. Такое исследование позволит значительно улучшить наше понимание инфекционных белковых патогенных микроорганизмов. Физиологии и патофизиологии IPRP C неясны в настоящее время. Примечательно, что в новой ID-entified прионных болезней человека называют переменно-протеазы чувствительной prionopathy, мы нашли новый PrPSc, которая разделяет иммунореактивного поведения и фрагментации с IPRP C 11, 12. Кроме того, недавно мы показали, что IPRP C является основным видом, который взаимодействует с β-амилоидных белков в болезнь Альцгеймера 13. В том же исследовании, эти методы были использованы для выделения Abeta агрегатов и олигомеров при болезни Альцгеймера 13, предполагая, их применение не-прионных белков агрегатов, участвующих в других нейродегенеративных заболеваний.
Protocol
1. Подготовка гомогената мозга и моющих средств водорастворимые (S2) и нерастворимые (P2) Фракции
- Принимать по 100 мг замороженных человеческих тканей головного мозга и добавить 100 мкл буфера для лизиса (10 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% ЭДТА, рН 7,4).
- Однородный его на льду с пестиком приводом от двигателя беспроводные, заморозить его в сухом льду в течение 5 мин и однородности его снова, используя пестик приводится в руках, а затем автомобильным и добавьте 300 мкл или 800 мкл буфера для лизиса (это либо 20- % или 10% общего гомогената головного мозга, соответственно).
- Центрифуга 20% или 10% общего гомогената мозга при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° C для сбора супернатант (S1), используя настольные центрифуги.
- Ультрацентрифуге 10% S1 при 35000 оборотов в минуту (100.000 мкг) в SW55 ротора (Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния) в течение 1 ч при 4 ° C. Передача супернатант (S2), которые содержат моющее-растворимой фракции в чистую пробирку. Ресуспендируют гранулы, которые содержат моющие средства нерастворимыхфракция (P2) в 100 мкл или 200 мкл буфера для лизиса, чтобы сделать 10 - или 5-кратный концентрированный препарат.
- Для PK-пищеварение, инкубировать образца с таким же количеством ПК на уровне 50 мкг / мл при 37 ° C в течение 1 часа для S2 и P2 фракций. Добавить фенилметилсульфонилфторида в конечной концентрации 5 мМ и равных объемах SDS буфера для образца (3% SDS, 2 мМ ЭДТА, 4% β-меркаптоэтанола, 10% глицерин, 50 мМ Трис, рН 6,8) прекратить PK пищеварения. Отварить образцы в течение 10 минут и охладить при комнатной температуре в течение 5 мин. Они готовы на Вестерн-блоттинга.
2. Скорость седиментации в градиентах сахарозы шаг
- Инкубируют 450 мкл 20% S1 с равным объемом 2% sarkosyl в H 2 O в течение 30 минут на льду.
- Добавить 0,5 мл 60%, 30%, 25%, 20%, 15% и 10% сахарозы в трубку Beckman с максимальной мощностью 5 мл.
- Загрузите 0,4 мл S1 на вершину 10-60% сахарозы градиенты шаг.
- Центрифуга на 48.000 мин (200.000 XG, SW55 роторе) в течение 1 ч при 4 ° C.
- Соберите 283 мкл фракции каждой из верхней части трубки и получить 12 фракций в общей сложности.
- Принимать по 20 мкл каждой фракции в новую пробирку Eppendorf, добавить 20 мкл буфера для образца, и кипятить в течение 10 мин.
- Прохладный образцов в течение 4 минут в капот, центрифугируют при 1000 х г в течение 1 мин и вихревые них. Загрузка образцов на сборных гель.
3. Эксклюзионной хроматографии
- Используйте Superdex 200 HR бусины (Pharmacia, Упсала, Швеция) в 1 х 30 см столбца, чтобы определить состояние олигомерных молекул PrP.
- Семь молекулярных маркеров массы (Sigma, Сент-Луис, MI), включая декстрана синего (2.000 кДа), тиреоглобулина (669 кДа), апоферритина (443 кДа), β-амилазы (200 кДа), алкогольдегидрогеназы (150 кДа), альбумин ( 66 кДа), и карбоангидразы (29 кДа), которые загружаются самостоятельно в концентрациях, рекомендованных Sigma в 200 мкл объема образца.
- Объем элюирования синий DextRAN используется для определения свободного объема (V 0 = 8,45 мл) и общий объем (V T = 24 мл) обеспечивается продуктом обучения. Пик объемов элюирования (V е) рассчитываются по хроматограмме и дробной удержаний. К пр-т, коэффициент распределения (определение образцов поведения), рассчитывается по следующей формуле: K пр = (V E - V 0) / (V т - V 0). Калибровочной кривой определяют путем построения K AV белка стандарты в отношении журнала МВт стандартов 8.
- Молекулярной массы (ММ) различных видов PrP восстановленные в разных FPLC фракции оценивается по калибровочной кривой, созданных с помощью гель-фильтрации различных стандартов.
- Inject 200 мкл S1 в буфере для лизиса, содержащего 1% sarkosyl в колонке для каждого запуска.
- Хроматография выполняется в системе FPLC (GE Healthcare) при скорости потока 0,25 мл / мин и фракциис 0,25 мл каждый, собранные с помощью коллектора фракций (Amersham Biosciences, RediFrac).
- Инкубируйте 0,125 мл каждая фракция с 0,5 мл предварительно охлажденного метанола при -20 ° C в течение 2 часов.
- Центрифуга образцов при 13000 х г в течение 30 мин при 4 ° C в настольной микроцентрифуге. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 20 мкл образца SDS буфера, как уже упоминалось выше, кипячением в течение 10 мин, охладить до комнатной температуры, загрузить их на сборные гель.
4. Захват PrP по G5p
- Молекула G5p (100 мкг) (любезно предоставлена доктором. Джефф Нил и Джон McGeehan из Университета Портсмута, Великобритания) сопряжена с 7 х 10 8 тозил активировать магнитных шариков путем инкубации G5p 100 мкг и 350 мкл бисером G5p в 1 мл фосфатно-солевым буфером (PBS) при 37 ° C в течение 20 часов. Привлечь G5p-шарики к боковой стенке трубы Эппендорф внешних магнитных сил, а затем удалите все решения. Вымойте бисером с 1 мл PBS содержащие0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в три раза.
- Инкубируйте G5p конъюгированных бисера в 1 мл 0,2 М Трис-HCl, рН 7,4, содержащем 0,1% BSA при 37 ° C в течение 5 часов, чтобы заблокировать неспецифического связывания и затем промыть бусины с 1 мл PBS, содержащем 0,1% БСА для в три раза выше. Снимите решение и добавить 1 мл PBS в бисер. Подготовленные бусины G5p стабильны в течение не менее 3 месяцев при 4 ° C.
- Захват PrP по G5p осуществляется путем инкубации 100 мкл S1 фракций или P2 с 60 мкл G5p сопряженных бисером (10 мкг белка / 6 X 10 7 бусин) в 1 мл буфера для связывания (3% Tween-20, 3% NP- 40 в PBS, рН 7,5).
- После инкубации с постоянной ротации в течение 3 часов при комнатной температуре, PrP содержащих G5p бусин привлекает к боковой стенке трубы Эппендорф внешних магнитных сил, что позволяет легко удаления всех несвязанных молекул в растворе.
- После трех промываний в промывочного буфера (2% Tween-20 и 2% NP-40 в PBS, рН 7.5), G5p бисера собираются и нагревали при 95 ° C в течение 5 мин в буфере образца SDS (3% SDS, 2 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 50 мМ Трис-HCl, рН 6,8).
- После охлаждения образцов в течение 5 мин при комнатной температуре, образцы центрифугируют при 1000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Супернатанты готовы для вестерн-блоттинга.
5. Вестерн-блоттинга
- Нагрузка образцы кипятили в буфере образца SDS на 15% Трис-HCl Критерий сборных гелях (Bio-Rad) при 150 V в течение ~ 80 мин.
- Белков на гелях переданы PVDF течение 2 ч при 70V.
- После блокирования мембран в 5% молока в трис-буферном растворе, содержащем 0,01% Твин-20 (TBS-T), мембраны инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с первичной моноклональных или поликлональных антител 3F4 (1:40,000), 1E4 (1 : 1.000), анти-N 8 (1:6,000), или анти-C 8 (1:6,000) для зондирования PrP молекулы.
- После инкубации с HRP-конъюгированных овец анти-мышиных IgG в1:3000, или осла анти-IgG кролика на 1:3000 PrP полосы визуализируются на Kodak пленки с использованием ECL Plus, в соответствии с протоколом производителя.
6. Представитель Результаты
По сравнению с CJD спорадические образцы, небольшое количество IPRP C был обнаружен в P2 фракции в нормальном мозге, хотя большинство из PrP C был восстановлен в S2 фракции (рис. 1). Как указывалось ранее 8, IPRP составляет примерно 5-25% от общего числа PrP в том числе полнометражных и N-терминально усеченного вида.
Анализ использования сахарозы шаг градиента осаждения показало, что в то время как большинство PrP C от не-CJD мозг был восстановлен в верхней фракции 1-3, небольших количеств PrP были также обнаружены в нижней фракции 9-11, которые обычно содержат большие агрегаты 8 (Рисунок 2).
Различные виды PrP Sc позвонилния из мономеров, олигомеров небольших в более крупные агрегаты выделяли гель-фильтрации в мозг с Крейтцфельдта-Якоба (рис. 3А). Тем не менее, небольшое количество крупных агрегатов с молекулярной массой более 2000 кДа был также обнаружен в нерастворимые фракции нормальных мозгах (рис. 3). Кроме того, димеров и тетрамеров PrP C были обнаружены не только в нерастворимые фракции, но и в растворимой фракции (рис. 3В и 3С).
После лечения ПК и PNGase, PrP захвачен G5p был обнаружен с 1E4 антитела против PrP97-105 8. Три PK-устойчивых фрагментов ядро называется PrP * 20, * 19 PrP, и PrP * 7 было обнаружено, мигрирующие на ~ 20 кДа, 19 кДа ~ и ~ 7 кДа, соответственно (рис. 4, слева). Тем не менее, не PrP была обнаружена, когда 1E4 антитела предварительно инкубировали с синтетический пептид, который имеет последовательность идентческих к 1E4 эпитопу (рис. 4, средняя панель), указывая, что полосы обнаружены 1E4 являются PrP фрагментов. Кроме того, анти-С антитела обнаружены два различных фрагментов PrP миграции на ~ 18 кДа (PrP * 18) и ~ 12-13 кДа (PrP-CTF12/13), в дополнение к PrP * 20 (рис. 4, справа).
Рисунок 1. Обнаружение IPRP C и IPRP н. После обработки PNGase F в 1/10 от общего объема реакции при 37 ° С в течение 1 часа, чтобы удалить гликанов от белка, в полный рост или N-терминально усеченных PrP видов растворимых и нерастворимых фракций (S2 и P2) изолированная ультрацентрифугированием в мозг выборках из нормальной управления (CTL) и спорадические CJD (SCJD) были обнаружены с 3F4 против PrP106-112 (левая панель), анти-N от PrP23-40 (средняя панель) и анти-C против PrP220-231 (правая панель). В CTL образцов, небольшое количество PrP обнаружен в P2, в то время как большое количество присутствует в S2. В отличие от более PrP обнаружен в P2, чем в S2 в SCJD образцов.
Рисунок 2. Осаждение PrP в градиентах сахарозы шаг. PrP в отдельных фракций от 1 до 11 не-CJD S1 мозга образца было обнаружено вестерн-блоттинга с 3F4. Хотя большинство из PrP C был обнаружен в верхней фракции 1-3, небольшие количества PrP наблюдались также в нижней фракции 9-11. Кроме того, полосы структуре PrP сверху и снизу иная: PrP восстановился в верхней фракции имеет доминирующее верхней полосе в то время как PrP восстановился в нижней фракции имеет доминирующее нижней полосы. PK-лечение PrPSc, были загружены в качестве контроля на правой стороне пятно.
Рисунок 4. Обнаружение различных PK-устойчивых IPRP фрагментов в G5p обогащенные препараты из нормального человеческого мозга. Образцы обогащенный G5p лечили ПК и PNGase F до Вестерн-блоттинга зондирования 1E4 (слева), 1E4 предварительно инкубировали с синтетического пептида, который был последовательность, идентичную 1E4 эпитопа (средняя панель) и анти-C ( правая панель). 1E4 обнаружил три PK-устойчивых фрагментов PrP называется PrP * 20, * 19 PrP, и PrP * 7 (левая панель). После блокирования 1E4 с пептидом, не PrP разрешение было обнаружено (средняя панель), что указывает на полосы обнаружены с 1E4 являются PrP фрагментов. Anti-C выявили две Кроме того PK-устойчивых фрагментов PrP называется PrP * 18 и PrP-CTF12 /13, в дополнение к PrP * 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сочетание подходов сообщили здесь изолирует последовательно нерастворимые агрегаты PrP C и растворимого PrP C олигомеров от нормального человеческого мозга. Ультрацентрифугирования при 100000 х г в течение одного часа является классическим методом, который широко используется для отделения нерастворимых PrPSc, от растворимого PrP C 14. В то время как эффективные, одна из предупреждает, чтобы избежать загрязнения во время тянет супернатант (S2) после центрифугирования. Поскольку гель профиль IPRP С отличной от PrP C, маловероятно, что PrP обнаружены в P2 фракции результате загрязнения S2. Осаждения градиента сахарозы анализа была использована отделить различные виды PrPSc, в зависимости от их плотности, размеров и формы 15. Мы заметили, что доля 12 часто содержит частицы, которые могут сделать эту фракцию необъяснимым. Доля 10 часто является тот, который содержит Greatesт количества PrP агрегатов между фракциями собрано 8. Молекулярной массы (ММ) различных конформеров PrP C были дополнительно характеризуется использованием гель-фильтрации (также называется хроматографии исключения). Мы впервые подготовлено калибровочной кривой с семи молекулярных маркеров массы (данные не приведены), а затем рассмотрели МВт PrP от мозга нормального контроля и SCJD пациентов. Мы отметили, что небольшое количество агрегатов PrP может быть спровоцирован вместе с сотовой мусора в ходе подготовки S1 фракции. Для увеличения скорости восстановления, тканях мозга следует перемешать хорошо и инкубации гомогената мозга с sarkosyl решение должно быть распространено на полчаса или час при 4 ° C. Хотя нет никаких ограничений на объем G5p захвата IPRP C, мы рекомендуем использовать от 60 до 80 мкл из бисера и от 100 до 200 мкл образцов для каждого эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность человеческого мозга и спинного ресурсный центр Fluid (Лос-Анджелес, Калифорния) для обеспечения нормальных образцов мозга. Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) R01NS062787, CJD фонд, Альянс BioSecure, а также центр университета по проблемам старения и здоровья при поддержке МакГрегор фонда и дискреционного фонда Президента (Case Western Reserve University) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
References
- Prusiner, S. B.
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
- Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
- Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
- Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
- Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
- Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
- Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
- Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
- Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
- Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
- Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
- Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
- Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).
- Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).
