Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Isolering av lösliga och olösliga PrP Oligomerer i den normala humana hjärnan

Published: October 3, 2012 doi: 10.3791/3788
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Pathology, National Prion Disease Pathology Surveillance Center, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Department of Neurology, National Prion Disease Pathology Surveillance Center, Case Western Reserve University School of Medicine

Summary

En ny art av cellulärt prionprotein (PrP

Abstract

Den centrala händelsen i patogenesen av prionsjukdomar omfattar en omvandling av värd-kodade cellulärt prionprotein PrP ^ till dess patogena isoform PrP ^ 1. PrP C är tvättmedel-löslig och känsliga för proteinas K (PK)-nedbrytning, medan PrP bildar tvättmedel olösliga aggregat och är delvis resistent mot PK 2-6. Omvandlingen av PrP ^ till PrP ^ är känt för att involvera en konformationsförändring övergång av α-helix till β-arkstrukturer av proteinet. Emellertid är in vivo-reaktionsvägen fortfarande dåligt förstådd. Ett preliminärt endogen PrP, mellanliggande PrP * eller "tyst prion", har ännu inte identifieras i infekterade hjärnan 7.

Med en kombination av biofysiska och biokemiska metoder, identifierade vi olösliga PrP C aggregat (betecknade iPrP C) från infekterade däggdjur hjärnor och odlade neuronalaceller 8, 9. Här beskriver vi detaljerade förfaranden av dessa metoder, inkluderande ultracentrifugering i detergentbuffert, sukros-steggradient sedimentering, storleksuteslutande kromatografi, iPrP anrikning av gen 5-proteinet (G5p) som specifikt binder till strukturellt förändrade PrP former 10 och PK-behandling. Kombinationen av dessa metoder isolerar inte bara olöslig PrP och PrP C aggregat, men också lösliga PrP C oligomerer från det normala mänskliga hjärnan. Eftersom protokollen beskrivs här har använts för att isolera både PrP från infekterade hjärnor och iPrP C från oinfekterade hjärnor, ger de oss en möjlighet att jämföra skillnader i fysikalisk egenskaper, neurotoxicitet och smittsamhet mellan de två isoformer. En sådan studie kommer att avsevärt förbättra vår förståelse av de smittsamma proteinhaltiga patogener. Fysiologi och patofysiologi iPrP C är oklar i dagsläget. Särskilt i en nyligen identified människor prionsjukdom kallas variabelt proteaskänsliga prionopathy fann vi en ny PrP som delar immunreaktiva beteende och fragmentering med iPrP C 11, 12. Dessutom visade vi nyligen att iPrP C är den viktigaste arter som interagerar med amyloid-β protein i Alzheimers sjukdom 13. I samma studie var dessa metoder för att isolera Abeta aggregat och oligomerer vid Alzheimers sjukdom 13, vilket tyder på deras tillämpning på icke-prion proteinaggregat involverade i andra neurodegenerativa sjukdomar.

Protocol

1. Framställning av hjärnhomogenat och detergent-löslig (S2) och-Olösligt (P2) Fraktioner

  1. Ta 100 mg frusen human hjärnvävnad och tillsätt 100 pl lysbuffert (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4).
  2. Homogenisera den på is med mortelstöt drivs av en sladdlös motor, frysa den i torr is under 5 min och homogenisera den igen med mortelstöt drivs av händerna först och sedan av motorn, och tillsätt 300 pl eller 800 pl lysbuffert (detta är antingen 20 % eller 10% total hjärnhomogenat, respektive).
  3. Centrifugera 20% eller 10% totalt hjämhomogenat vid 1.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C för att samla supernatanten (S1) med användning av en bordscentrifug.
  4. Ultracentrifug 10% S1 vid 35.000 rpm (100.000 x g) i en SW55 rötor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) under 1 h vid 4 ° C. Överför supernatanterna (S2) som innehåller detergent-lösliga fraktionen till ett rent rör. Återsuspendera de pellets som innehåller detergent-olösligafraktion (P2) i 100 pl eller 200 pl av lyseringsbuffert att 10 - eller 5-faldigt koncentrerad beredning.
  5. För PK-digerering, inkubera provet med samma mängder av PK vid 50 pg / ml vid 37 ° C under 1 timme för både S2 och P2 fraktioner. Lägg fenylmetylsulfonylfluorid vid den slutliga koncentrationen av 5 mM och lika volymer av SDS-provbuffert (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-merkaptoetanol, 10% glycerol, 50 mM Tris, pH 6,8) för att avsluta PK matsmältningen. Koka proverna för 10 min och kyla dem vid rumstemperatur under 5 minuter. De är redo för Western blotting.

2. Velocity sedimentering i Övertoningar Sackaros Steg

  1. Inkubera 450 pl 20% S1 med en lika stor volym av 2% sarkosyl i H 2 O under 30 min på is.
  2. Tillsätt 0,5 ml vardera av 60%, 30%, 25%, 20%, 15%, och 10% sackaros i en Beckman rör med en maximal 5 ml kapacitet.
  3. Fyll 0,4 ml S1 på toppen av 10-60% sackaros-gradienter steg.
  4. Centrifugera vid 48.000 rpm (200.000 xg, SW55 rotor) för 1 timme, vid 4 ° C.
  5. Samla 283 pl vardera fraktion från toppen av röret och erhålla 12 fraktioner totalt.
  6. Ta 20 | il av varje fraktion till en ny Eppendorf-rör, tillsätt 20 pl provbuffert, och koka under 10 min.
  7. Cool prover för 4 min i huv, centrifugera vid 1.000 x g under 1 min och vortexa dem. Ladda prover på en förgjuten gel.

3. Size Exclusion Chromatography

  1. Använd Superdex 200 HR pärlor (Pharmacia, Uppsala, Sverige) i en 1 x 30 cm kolonn för att bestämma den oligomera tillståndet av PrP molekyler.
  2. Sju molekylära massamarkörer (Sigma, St Louis, Ml) innefattande Dextran blå (2.000 kDa), tyroglobulin (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amylas (200 kDa), alkoholdehydrogenas (150 kDa), albumin ( 66 kDa), och kolsyreanhydras (29 kDa) laddas oberoende vid de koncentrationer som rekommenderats av Sigma 200 il provvolymer.
  3. Elueringsvolymen blå DEXTRAN används för att bestämma den tomma volymen (V 0 = 8,45 ml) och den totala volymen (Vt = 24 ml) ges av produkten instruktionen. Topp elueringsvolymer (V e) beräknas från kromatogrammet och fraktionerad självbehåll. K AV, fördelningskoefficienten (definiera prov beteende), beräknas med hjälp av ekvationen: K AV = (V e - V 0) / (V t - V 0). Kalibreringskurvan bestäms genom att rita K AV för proteinstandarder mot log MW för standarder 8.
  4. Molekylvikten (MW) av de olika PrP arter återvunnits i olika FPLC-fraktioner utvärderas enligt en kalibreringskurva genererad med gelfiltrering av olika standarder.
  5. Injicera 200 ul S1 i lysbuffert innehållande 1% sarkosyl i kolonnen för varje körning.
  6. Kromatografi utförs i ett FPLC-system (GE Healthcare) vid en flödeshastighet av 0,25 ml / min och fraktions av 0,25 ml vardera uppsamlas med användning av en fraktionsuppsamlare (Amersham Biosciences, RediFrac).
  7. Inkubera 0,125 ml vardera fraktion med 0,5 ml i förväg kyld metanol vid -20 ° C under 2 timmar.
  8. Centrifugera proverna vid 13.000 xg i 30 minuter vid 4 ° C i en bänk mikrocentrifug. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 20 pl SDS-provbuffert som nämnts ovan, kokning under 10 minuter, kyl till rumstemperatur, ladda dem på en förgjuten gel.

4. Fånga av PrP av G5p

  1. Den G5p molekylen (100 pg) (tillhandahölls vänligt av Dr. Geoff Kneale och John McGeehan från University of Portsmouth, Storbritannien) är konjugerad till 7 x 10 8 tosyl aktiverat magnetiska kulor genom inkubering 100 pg G5p och 350 ul pärlor G5p i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 ° C under 20 timmar. Attract G5p-pärlor till sidovägg Eppendorfrör av yttre magnetisk kraft och ta bort alla lösning. Tvätta pärlorna med 1 ml PBS innehållande0,1% bovint serumalbumin (BSA) under tre gånger.
  2. Inkubera G5p-konjugerade pärlorna i 1 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 innehållande 0,1% BSA vid 37 ° C under 5 timmar för att blockera icke-specifik bindning och sedan tvätta pärlorna med 1 ml PBS innehållande 0,1% BSA för tre gånger enligt ovan. Avlägsna lösningen och tillsätt 1 ml PBS i pärlorna. De framställda G5p pärlorna är stabila under minst 3 månader vid 4 ° C.
  3. Infångandet av PrP av G5p utförs genom inkubering 100 il S1 fraktioner eller P2 med 60 pl G5p konjugerade pärlor (10 | ig protein / 6 x 10 7 pärlor) i 1 ml bindningsbuffert (3% Tween-20, 3% NP- 40 i PBS, pH 7,5).
  4. Efter inkubering med konstant rotation under 3 timmar vid rumstemperatur, är de PrP-innehållande pärlor G5p attraheras sidovägg Eppendorfrör genom yttre magnetisk kraft, vilket möjliggör enkel borttagning av alla obundna molekyler i lösningen.
  5. Efter tre tvättar i tvättbuffert (2% Tween-20 och 2% NP-40 i PBS, pH 7.5) Är G5p pärlor uppsamlades och upphettades vid 95 ° C under 5 min i SDS-provbuffert (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
  6. Efter kylning prover under 5 minuter vid rumstemperatur, proverna centrifugeras vid 1.000 x g under 5 min vid rumstemperatur. Supernatanterna är redo för Western blotting.

5. Western Blotting

  1. Load prover kokades i SDS-provbuffert till 15% Tris-HCl Criterion prefabricerade geler (Bio-Rad) vid 150 V under ~ 80 minuter.
  2. Proteinerna på gelerna överfördes till PVDF under 2 timmar vid 70V.
  3. Efter blockering membran i 5% mjölk i Tris-buffrad saltlösning innehållande 0,01% Tween-20 (TBS-T), är membranen inkuberades under 2 h vid rumstemperatur med primära monoklonala eller polyklonala antikropp 3F4 (1:40,000), 1E4 (1 : 1.000), anti-N 8 (1:6,000), eller anti-C-8 (1:6,000) för sondering av PrP-molekylen.
  4. Efter inkubering med HRP-konjugerad får-anti-mus-IgG vid1:3000, eller åsne-anti-kanin-IgG vid 1:3000 PRP banden visualiseras på Kodak-film med användning av ECL Plus i enlighet med tillverkarens protokoll.

6. Representativa resultat

Jämfört med sporadiska CJD prover, tillsattes en liten mängd C-iPrP detekteras i P2-fraktionen i normala hjärnor men de flesta av PrP C utvanns i S2-fraktionen (figur 1). Såsom angivits tidigare 8, iPrP står för cirka 5-25% av den totala PrP inklusive fullständig längd och N-terminalt trunkerade arter.

Analyser som använder sackaros sedimentering steggradient avslöjade att medan de flesta av PrP C från icke-CJD hjärnor utvanns i de bästa fraktionerna 1-3, tillsattes små mängder av PrP detekterades också i de nedre fraktionerna 9-11, som normalt innehåller stora aggregat 8 (figur 2).

En mängd PrP Sc arter ringdening från monomerer, små oligomerer till större aggregat isolerades genom gelfiltrering i hjärnan med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom (figur 3A). Emellertid en liten mängd av större aggregat med molekylvikt större än 2.000 kDa detekterades också i olösliga fraktioner av normala hjärnor (Figur 3C). Dessutom har dimerer och tetramerer av PrP C inte bara detekteras i olösliga fraktioner utan också i lösliga fraktioner (Figur 3B och 3C).

Efter PK och PNGas behandling, PrP fångades av G5p detekteras med 1E4 antikroppen mot PrP97-105 8. Tre PK-resistenta core fragment benämns PrP * 20, PrP * 19, och PrP * 7 detekterades, migrerande vid ~ 20 kDa, ~ 19 kDa och ~ 7 kDa, respektive (Figur 4, vänstra panelen). Dock ingen PrP detekteras när 1E4 antikroppen förinkuberades med en syntetisk peptid som har en sekvens identiCal till 1E4 epitopen (Figur 4, mellersta panel), vilket indikerar att band som detekteras av 1E4 är PrP fragment. Dessutom visade anti-C-antikropp två olika PrP fragment migrerar till ~ 18 kDa (PrP * 18) och ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), förutom PrP * 20 (figur 4, högra panelen).

Figur 1
Figur 1. Detektion av iPrP C och iPrP Sc. Efter behandling med PNGase F vid 1/10 av den totala reaktionsvolymen vid 37 ° C under 1 h för att avlägsna glykaner från proteinet, fullängds eller N-terminalt trunkerat PrP arter i de lösliga och olösliga fraktionerna (S2 och P2) isolerad genom ultracentrifugering i hjärnvävnad från normal kontroll (CTL) och sporadisk CJD (s-CJS) detekterades med 3F4 mot PrP106-112 (vänster panel), anti-N mot PrP23-40 (mellersta fältet), och anti-C mot PrP220-231 (högra panelen). I CTL prov, en liten mängd av PrP detekterades i P2, medan en stor mängd är närvarande i S2. I motsats, är mer PrP detekteras i P2 än i S2 i s-CJS prover.

Figur 2
Figur 2. Sedimentering av PrP i gradienter sackaros steg. PrP i individuella fraktioner från 1 till 11 icke-CJS S1 hjärnan prov detekterades genom Western blotting med 3F4. Även om de flesta av PrP C detekterades i topp fraktioner 1-3, tillsattes små mängder av PrP även observerats i botten fraktionerna 9-11. Dessutom är det bandmönstret av PrP ovanifrån och underifrån annorlunda: PrP återfanns i de bästa fraktionerna har en dominerande övre bandet medan PrP återfanns i botten fraktionerna har en dominerande undre bandet. En PK-behandlade PrP ^ laddades som en kontroll på den högra sidan av blotten.

"Bild Figur 3. Detektion av lösliga och olösliga PrP C oligomerer. Lösliga och olösliga PrP C från normala humana hjärnor separerades genom ultracentrifugering och utsattes därefter för gelfiltrering, respektive. De molekylära storlekar individuella fraktioner mättes genom att köra en grupp av molekylära massmarkörer. (A) PrP art från s-CJS hjärnprover. Två populationer av PRP arter upptäcktes: gelfiltrerings fraktionerna 49 till 65 innehåller monomerer och små oligomerer, medan fraktionerna 27-33 innehåller stora aggregat. PRP C arter från löslig fraktion (S2) (B) och olöslig fraktion (P2) (C) i normala kontroller detekterades. PRP sonderades med 3F4 antikroppen. Dimerer (fraktion 55) och tetramerer (fraktion 51) av PrP detekterades inte bara i P2 utan också i S2 hjärnans normala samples (B och C). Stora aggregat endast detekterades i P2 av normala prover (C).

Figur 4
Figur 4. Detektering av olika PK-resistenta iPrP fragment i G5p-berikade preparat från normala mänskliga hjärnor. Prover anrikade genom G5p behandlades med PK och PNGas F före Western blotting probning med 1E4 (vänstra panelen), 1E4 förinkuberad med en syntetisk peptid som hade en sekvens identisk med den 1E4 epitopen (mellersta fältet), och anti-C-( högra panelen). 1E4 upptäckt tre PK-resistenta PrP-fragment kallas PrP * 20, PrP * 19 och PrP * 7 (vänstra panelen). Efter blockering av 1E4 med peptiden, var ingen PrP res detekterades (mellersta fältet), vilket indikerar att banden detekterade med 1E4 är PrP fragment. Anti-C avslöjade två tillägg PK-resistenta PrP fragment kallas PrP * 18 och PrP-CTF12 /13, förutom PrP * 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kombinationen av metoder som redovisas här isolerar genomgående olösliga PrP C aggregat och lösliga PrP C oligomerer från det normala mänskliga hjärnan. Ultracentrifugering vid 100.000 xg under en timme är en klassisk metod som har använts i stor utsträckning för separation av den olösliga PrP från den lösliga PrP ^ 14. Även om det är effektivt, ett av varningar är att undvika kontamination under dra supernatanten (S2) efter centrifugering. Eftersom gelén profil iPrP C är skiljer sig från PrP ^, är det osannolikt att PrP detekterades i P2-fraktionen resulterade från kontaminering av S2. Sackarosgradienten sedimentering analys har använts för att separera olika PrP Sc arter baserat på deras densiteter, storlekar och former 15. Vi har märkt att andelen 12 ofta innehåller en del partiklar som kan göra denna fraktion oansvariga. Fraktion 10 är ofta den som innehåller de greatest mängder PrP aggregat bland fraktioner 8. Molekylvikterna (MW) av olika PrP C konformer karaktäriserades vidare användning av gelfiltrering (även kallad storlek kromatografi). Vi genererade först en kalibreringskurva med sju molekylära massamarkörer (data ej visade) och undersöktes sedan MW av PrP från hjärnor från normala kontroller och s-CJS patienter. Vi noterade att en liten mängd PrP aggregat kan utfällas tillsammans med cellrester under framställningen av S1 fraktion. För att öka återvinningsgraden bör hjärnan vävnader homogeniseras väl och inkubering av hjärnhomogenat med sarkosyl lösningen bör utvidgas till en halvtimme eller en timme vid 4 ° C. Även om det finns ingen volym begränsning för G5p infångning av iPrP C rekommenderar vi att du använder 60 till 80 pl pärlor och 100 till 200 ul prover för varje experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Den Författarna är tacksamma för den mänskliga hjärnan och ryggmärgsvätskan Resource Center (Los Angeles, Kalifornien) för att tillhandahålla normala hjärnan prover. Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NIH) R01NS062787 har CJD Foundation, Alliance biologiskt säkra, liksom University Center on Aging och hälsa med stöd av McGregor Foundation och presidentens Discretionary fond (Case Western Reserve University) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626 72 mM in 2-propanol
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308 2 mg/ml in H2O
PNGase F New England Biolabs MWGF200
Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor Beckman Coulter Part No. 365668, 356860
Superdex 200 HR beads GE Healthcare 17-1088-01
AKTA FPLC system GE Healthcare 18-1900-26
Molecular weight markers Sigma-Aldrich MWGF200 Varied
Dynabeads M-280 magnetic beads Invitrogen 143-01
3F4 antibody Covance SIG-39600
1E4 antibody Cell Sciences M1840
Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels Bio-Rad 345-0020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
  2. Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
  3. Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
  4. Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
  5. Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
  6. Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
  7. Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
  8. Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
  9. Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
  10. Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
  11. Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
  12. Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
  13. Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
  14. Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).
  15. Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).

Tags

Medicin neurovetenskap fysiologi anatomi prionprotein hjärna prionsjukdom olösligt prionprotein oligomer ultracentrifugering Western blotting sackarosgradient sedimentering gelfiltrering
Isolering av lösliga och olösliga PrP Oligomerer i den normala humana hjärnan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, X., Yuan, J., Zou, W. Q.… More

Xiao, X., Yuan, J., Zou, W. Q. Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain. J. Vis. Exp. (68), e3788, doi:10.3791/3788 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter