Summary
En ny art av mobilnettet prionproteinet (PrP
Abstract
Den sentrale begivenhet i patogenesen av prionsykdommer innebærer en konvertering av verten-kodede cellulær prionproteinet PrP C i sin sykdomsfremkallende isoform PrP Sc 1. PrP C er vaskemiddel-løselig og følsom for proteinase K (PK)-fordøyelsen, mens PrP Sc danner vaskemiddel-uoppløselige aggregater og er delvis resistent til PK 2-6. Omdannelsen av PrP C til PrP Sc er kjent for å omfatte en konformasjonsendring overgang av α-spiralformede til β arks strukturer av protein. Imidlertid er in vivo pathway fremdeles dårlig forstått. En foreløpig endogene PrP Sc, middels PrP * eller "silent prion", har ennå ikke identifisert i infisert hjernen 7.
Ved hjelp av en kombinasjon av biofysiske og biokjemiske metoder, identifiserte vi uløselige PrP C aggregater (betegnet iPrP C) fra infiserte pattedyr hjerner og kulturperler neuronalceller 8, 9. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer av disse metoder, inkludert ultrasentrifugering i vaskemiddel buffer, sukrose trinngradient sedimentering, gelfiltrerings-kromatografi, iPrP oppformering etter genet 5 protein (G5p) som spesifikt binder seg til strukturelt endrede PrP skjemaer 10, og PK-behandling. Kombinasjonen av disse metodene isolerer ikke bare uløselig PrP Sc og PrP C tilslag, men også løselig PrP C oligomerer fra normal menneskelig hjerne. Siden protokoller som er beskrevet her har blitt brukt til å isolere både PrP Sc fra infiserte hjerner og iPrP C fra friske hjerner, de gir oss en mulighet til å sammenligne forskjeller i fysisk-kjemiske egenskaper, nevrotoksisitet og smittsomhet mellom de to isoformer. En slik studie vil gi betraktelig bedre vår forståelse av de smittsomme proteinholdige patogener. Fysiologi og patofysiologi av iPrP C er uklart i dag. Spesielt, i en nylig-identified menneskelig prionsykdom kalles variabelt protease-sensitive prionopathy, fant vi en ny PrP Sc som deler immunoreaktiv atferd og fragmentering med iPrP 11 C, 12. Videre har vi nylig vist at iPrP C er den viktigste arten som samhandler med amyloid-β protein i Alzheimers sykdom 13. I den samme studien, ble disse metodene brukes til å isolere Ap aggregater og oligomerer i Alzheimers sykdom 13, noe som tyder sin søknad til ikke-prionproteinet tilslag involvert i andre nevrodegenerative lidelser.
Protocol
1. Fremstilling av Brain homogenat og vaskemiddel-oppløselige (S2) og-uoppløselig (P2) Fraksjoner
- Ta 100 mg frossen menneskelige hjernevev og tilsett 100 pl lysebuffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4).
- Homogenisere det på is ved hjelp av støter drevet av en batteridrevet motor, fryse den i tørris i 5 min og homogenisere det igjen ved hjelp av støter drevet av hendene først og deretter ved motor, og legge 300 pl eller 800 pl lysebuffer (dette er enten 20 % eller 10% totale hjerne homogenat, henholdsvis).
- Sentrifuger 20% eller 10% totale hjerne homogenat ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C for å samle supernatanten (S1) med en stasjonær sentrifuge.
- Ultrasentrifuge 10% S1 ved 35.000 rpm (100.000 xg) i en SW55 rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) i 1 time ved 4 ° C. Overfør supernatantene (S2) som inneholder vaskemiddel-oppløselig fraksjon i et rent rør. Resuspender pellets som inneholder vaskemiddel-uløseligfraksjon (P2) i 100 pl eller 200 pl lysis buffer for å gjøre 10 - eller 5-fold konsentrert preparat.
- For PK-fordøyelsen, inkuber prøven med de samme mengder av PK ved 50 ug / ml ved 37 ° C i 1 time for begge S2 og P2 fraksjoner. Legg phenylmethylsulfonyl fluorid ved sluttkonsentrasjon på 5 mm og like volumer av SDS prøvebuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-merkaptoetanol, 10% glyserol, 50 mM Tris, pH 6,8) for å avslutte PK fordøyelsen. Kok prøvene for 10 min og avkjøle dem ved romtemperatur i 5 min. De er klare for Western blotting.
2. Velocity Sedimentering i Sukrose Step overgangar
- Inkuber 450 ul 20% S1 med et likt volum av 2% sarkosyl i H 2 O i 30 min på is.
- Tilsett 0,5 ml hver av 60%, 30%, 25%, 20%, 15%, og 10% sucrose i en Beckman rør med en maksimal 5 ml kapasitet.
- Last 0,4 ml S1 på toppen av 10-60% sukrose trinn gradienter.
- Sentrifuger ved 48000 rpm (200.000 xg, SW55 rotor) i 1 time, ved 4 ° C.
- Samle 283 pl fraksjon hver fra toppen av røret og få 12 fraksjoner totalt.
- Ta 20 ul av hver fraksjon i nytt Eppendorf-rør, tilsett 20 ul prøvebuffer, og kok i 10 min.
- Kule prøver for 4 min i hette, sentrifuger ved 1000 xg i 1 min og virvle dem. Laster prøver på en pre-cast gel.
3. Gelfiltrerings kromatografi
- Bruk Superdex 200 HR perler (Pharmacia, Uppsala, Sverige) i en 1 x 30 cm kolonne for å bestemme tilstanden av oligomere PrP molekyler.
- Syv molekylære massen markører (Sigma, St. Louis, MI), inkludert Dextran blå (2000 kDa), tyroglobulin (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amylase (200 kDa), alkoholdehydrogenase (150 kDa), albumin ( 66 kDa) og karbonanhydrase (29 kDa) blir lastet uavhengig på konsentrasjonene anbefales av Sigma i 200 pl prøvevolumer.
- Den elueringsvolum av blå DEXTRAN er brukes til å bestemme void volum (V 0 = 8,45 ml) og det totale volum (V t = 24 ml) blir levert av produktet instruksjon. Toppenes elueringsmiddel volumer (V e) beregnes fra kromatogrammet og fraksjonelle skadegrense. K AV, fordelingskoeffisienten (definere prøve atferd), beregnes ved hjelp av ligningen: K AV = (V e - V 0) / (V t - V 0). Kalibreringskurven bestemmes ved å plotte K AV av protein-standarder mot log MW for standardene 8.
- Molekylvekten (MW) av de forskjellige PrP artene gjenfunnet i forskjellige FPLC fraksjoner er evaluert i henhold til en kalibreringskurve generert med gelfiltrering av ulike standarder.
- Injiser 200 ul S1 i lyseringsbuffer inneholdende 1% sarkosyl i kolonnen for hver kjøring.
- Kromatografi utføres i en FPLC-system (GE Healthcare) ved en strømningshastighet på 0,25 ml / min og fraksjons av 0,25 ml hver samles ved hjelp av en fraksjonssamler (Amersham Biosciences, RediFrac).
- Inkuber 0,125 ml hver fraksjon med 0,5 ml pre-kjølt metanol ved -20 ° C i 2 timer.
- Sentrifuger prøvene ved 13.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C i en stasjonær mikrosentrifuge. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 20 ul SDS prøvebuffer som nevnt ovenfor, koking i 10 min, avkjøles til romtemperatur, laste dem inn en pre-støpt gel.
4. Fangst av PrP av G5p
- Den G5p molekylet (100 mikrogram) (vennlig levert av Drs. Geoff Kneale og John McGeehan fra University of Portsmouth, UK) er konjugert til 7 x 10 8 tosyl aktivert magnetiske kuler ved inkubering 100 ug G5p og 350 ul G5p perler i 1 ml av fosfat-bufret saltløsning (PBS) ved 37 ° C i 20 timer. Tiltrekke G5p-perler til sideveggen av Eppendorf rør ved eksternt magnetisk kraft og deretter fjerne all løsning. Vask kulene med 1 ml PBS inneholdende0,1% bovint serumalbumin (BSA) for tre ganger.
- Inkuber G5p-konjugerte perler i 1 ml 0,2 M Tris-HCl, ° C pH 7,4 inneholdende 0,1% BSA ved 37 for 5 hr å blokkere ikke-spesifikk binding, og deretter vaske perlene med 1 ml PBS inneholdende 0,1% BSA for tre ganger som nevnt ovenfor. Fjerne løsning og tilsett 1 ml PBS inn i perlene. De preparerte G5p perler er stabil i minst 3 måneder ved 4 ° C.
- Fangst av PrP etter G5p utføres ved inkubering 100 ul S1 brøker eller P2 med 60 ul G5p konjugerte perler (10 ug protein / 6 x 10 7 perler) i 1 ml av bindende buffer (3% Tween-20, 3% NP- 40 i PBS, pH 7,5).
- Etter inkubasjon med konstant rotasjon i 3 timer ved romtemperatur, blir de PrP-holdige G5p perler tiltrukket sideveggen av Eppendorf-rør ved hjelp av ekstern magnetisk kraft, noe som muliggjør enkel fjerning av alle ubundne molekyler i løsningen.
- Etter tre vaskinger i vaskebuffer (2% Tween-20 og 2% NP-40 i PBS, pH 70,5), er G5p perler samlet og oppvarmet ved 95 ° C i 5 min i SDS prøvebuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
- Etter avkjøling prøvene i 5 min ved romtemperatur, blir prøvene sentrifugert ved 1000 xg i 5 min ved romtemperatur. Supernatantene er klare for Western blotting.
5. Western Blotting
- Last prøvene kokt i SDS prøvebuffer bort 15% Tris-HCl Criterion prefabrikerte gels (Bio-Rad) ved 150 V i ~ 80 min.
- Proteinene på gelene overføres til PVDF i 2 timer ved 70V.
- Etter blokkering membraner i 5% melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,01% Tween-20 (TBS-T), er membranene inkubert i 2 timer ved romtemperatur med primære monoklonale eller polyklonale antistoff 3F4 (1:40,000), 1E4 (1 : 1000), anti-N 8 (1:6,000), eller anti-C 8 (1:6,000) for sondering PrP molekylet.
- Etter inkubasjon med HRP-konjugert sau anti-mus IgG på1:3000, eller esel anti-kanin IgG i 1:3,000 PRP band er visualisert på Kodak film med ECL Plus, i samsvar med produsentens protokoll.
6. Representant Resultater
Sammenlignet med sporadiske CJD prøvene, ble en liten mengde iPrP C detektert i P2 fraksjonen i normale hjerner selv om de fleste av PrP C ble gjenopprettet i S2 fraksjonen (figur 1). Som indikert tidligere 8, iPrP utgjør cirka 5-25% av total PrP inkludert full-lengde og N-terminalt avkortede arter.
Analyser ved hjelp av sukrose trinngradient sedimentasjon avslørte at mens de fleste av PrP C fra ikke-CJD hjerner ble gjenvunnet i de beste fraksjoner 1-3, ble små mengder av PrP også påvist i de nederste fraksjonene 9-11 som normalt inneholder store aggregater 8 (Figur 2).
En rekke PrP Sc arter ringteing fra monomerer, ble det observert små oligomerer til større aggregater isolert ved gelfiltrering i hjernen med Creutzfeldt-Jakob sykdom (figur 3A). Imidlertid ble en liten mengde av større aggregater med molekylvekt større enn 2000 kDa også påvist i uoppløselige fraksjoner av normale hjerner (figur 3C). Videre ble dimerer og tetramerer av PrP C ikke bare påvist i uoppløselige fraksjoner, men også i oppløselige fraksjoner (figur 3B og 3C).
Etter PK og PNGase behandling, ble tatt av PrP G5p registreres med 1E4 antistoff mot PrP97-105 8. Tre PK-resistente kjerne fragmenter kalt PrP * 20, PrP * 19, og PrP * 7 ble oppdaget, migrere på ~ 20 kDa, ~ 19 kDa og ~ 7 kDa, henholdsvis (figur 4, venstre panel). Det ble imidlertid ikke PrP ble registrert da 1E4 antistoff var pre-inkubert med en syntetisk peptid som har en sekvens identical til 1E4 epitop (Figur 4, midtre panelet), noe som indikerer at band oppdaget av 1E4 er PrP fragmenter. Videre, anti-C antistoff avdekket to forskjellige PrP fragmenter migrerer på ~ 18 kDa (PrP * 18) og ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), i tillegg til PrP * 20 (fig. 4, høyre panel).
Figur 1. Påvisning av iPrP C og iPrP Sc. Etter behandling med PNGase F ved 1/10 av det totale reaksjonsvolum ved 37 ° C i 1 time for å fjerne glykaner fra proteinet, i full-lengde eller N-terminalt avkortet PrP arter i de oppløselige og uoppløselige fraksjoner (S2 og P2) isolert ved ultrasentrifugering i hjernen prøver fra normal kontroll (CTL) og sporadisk CJD (sCJD) ble påvist med 3F4 mot PrP106-112 (venstre panel), anti-N mot PrP23-40 (midtre panelet), og anti-C mot PrP220-231 (høyre panel). I CTL prøver, blir en liten mengde av PrP detektert i P2, mens en stor mengde er tilstede i S2. I kontrast er mer PrP oppdaget i P2 enn i S2 i sCJD prøver.
Figur 2. Sedimentering av PrP i sukrose trinn gradienter. PrP i individuelle fraksjoner 1-11 av ikke-CJD hjernen sample S1 ble påvist ved Western-blotting med 3F4. Selv om de fleste av PrP C ble påvist i beste fraksjoner 1-3, ble små mengder av PrP også observert i bunnen fraksjoner 9-11. Videre er banding mønsteret av PrP fra topp og bunn annerledes: PrP gjenfunnet i beste fraksjoner har en dominerende øvre båndet mens PrP gjenfunnet i de nederste fraksjoner har en dominerende nedre bånd. En PK-behandlet PrP Sc ble lastet som en kontroll på høyre side av blot.
Figur 3. Påvisning av oppløselige og uoppløselige PrP C oligomerer. Løselig og uløselig PrP C fra normale humane hjerner ble separert ved ultrasentrifugering og deretter underkastet gelfiltrering, henholdsvis. De molekylære størrelser av individuelle fraksjoner ble målt ved å kjøre en gruppe molekylære massen markører. (A) PrP Sc arter fra sCJD hjernen prøver. To populasjoner av PrP arter ble oppdaget: gelfiltrering fraksjoner 49-65 inneholder monomerer og små oligomerer, mens fraksjoner 27-33 inneholder store aggregater. PRP C arter fra løselig fraksjon (S2) (B) og uløselig fraksjon (P2) (C) av normale kontroller ble oppdaget. PrP ble undersøkt med 3F4 antistoffet. Dimerer (fraksjon 55) og tetramerer (fraksjon 51) av PrP ble detektert ikke bare i P2, men også i S2 av normal hjerne samples (B og C). Store aggregater ble bare detektert i P2 normale prøver (C).
Figur 4. Påvisning av ulike PK-resistente iPrP fragmenter i G5p-beriket preparater fra normale menneskelige hjerne. Prøver beriket av G5p ble behandlet med PK og PNGase F før Western blotting sondering med 1E4 (venstre panel), 1E4 pre-inkubert med en syntetisk peptid som hadde en sekvens identisk til den 1E4 epitop (midtre panel), og anti-C ( høyre panel). 1E4 oppdaget tre PK-resistente PrP fragmenter kalt PrP * 20, PrP * 19, og PrP * 7 (venstre panel). Etter blokkering av 1E4 med peptid, ble ingen PrP res oppdaget (i midten panel), som indikerer at bandene oppdages med 1E4 er PrP fragmenter. Anti-C avdekket to tillegg PK-resistente PrP fragmenter kalt PrP * 18 og PrP-CTF12 /13, i tillegg til PrP * 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinasjonen av tilnærminger som rapporteres her isolerer konsekvent uløselige PrP C aggregater og løselig PrP C oligomerer fra normal menneskelig hjerne. Ultrasentrifugering ved 100.000 xg i en time er en klassisk metode som har vært mye brukt for separering av det uløselige PrP Sc fra løselig PrP C 14. Mens den er effektiv, en av de forsiktighetsregler er å unngå forurensning under trekking supernatanten (S2) etter sentrifugering. Siden gel profilen iPrP C er forskjellig fra PrP C, er det lite sannsynlig at PrP oppdaget i P2 fraksjonen resulterte fra forurensning av S2. Den sukrosegradient sedimentering analysen har blitt brukt til å separere ulike PrP Sc arter basert på deres tetthet, størrelser og former 15. Vi har lagt merke til at den fraksjonen 12 ofte inneholder noen partikkel som kan gjøre denne fraksjonen uforklarlig. Fraksjon 10 er ofte en som inneholder greatest mengder PrP tilslag blant fraksjonene samlet 8. Molekylvektene (MW) av ulike PrP C conformers ble videre karakterisert ved hjelp av gelfiltrering (også kalt gelfiltrerings kromatografi). Vi først generert en kalibreringskurve med syv molekylære massen markører (data ikke vist) og deretter undersøkt på MW av PrP fra hjernene til normale kontroller og sCJD pasienter. Vi bemerket at en liten mengde av PrP aggregater kan utfelles sammen med celle-debris under forberedelse av S1 fraksjon. Å øke utvinningsgraden, bør hjernevev homogeniseres godt og inkubering av hjernen homogenat med sarkosyl oppløsningen bør utvides til en halv time eller en time ved 4 ° C. Selv om det er ingen volum begrensning for G5p fangst av iPrP C, anbefaler vi å bruke 60-80 ul perler og 100-200 ul prøver for hvert forsøk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Den Forfatterne er takknemlige for den menneskelige hjerne og spinalvæske Resource Center (Los Angeles, CA) for å gi normal hjerne prøver. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, den CJD Foundation, Alliance BioSecure, samt University Center on Aging og helse med støtte fra McGregor Foundation og presidentens Konjunkturfølsomme Fund (Case Western Reserve University) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
References
- Prusiner, S. B.
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
- Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
- Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
- Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
- Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
- Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
- Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
- Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
- Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
- Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
- Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
- Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
- Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).
- Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).
