Summary
I denne undersøgelse beskriver vi en forbedret protokol til et multiplekset high-throughput-antistof mikroarray med lectin påvisningsmetode, der kan anvendes i glycosylering profilering af specifikke proteiner. Denne protokol indeholder nye pålidelige reagenser og reducerer den tid, omkostninger og lab krav til udstyr i forhold til den tidligere procedure.
Protocol
1. Udskrive en Antistof Microarray for assayet
- Fortyndes alle antistoffer til 0,5 mg / ml i phosphatbufret saltvand, pH 7,2 (PBS).
- Portion 40 ul af hvert antistof i 384-brønds kilde plade.
- Læg 384-brønds source plade på Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer.
- Læg 20 PATH microarray glider på microarrayer som mål.
- Indstille microarrayer at udskrive 48 identiske subarrays, hvor 27-antistoffer og kontrol proteiner plettede in triplo i en 9x9 mønster (fig. 1E, 1F).
- Start microarrayer at udskrive de antistof microarray dias.
- Saml antistof microarray dias, og gemme dem i dias kassette med tørremiddel. Vakuumtætning kassetten i en plastpose ved hjælp vakuum sealer (Foodsaver).
- Lagring af de forseglede microarray objektglas ved 4 ° C i køleskab.
2. Kemisk Bloker Antibody Microarray til forebyggelse GBPBinde til indfangnings-antistoffer
Den microarray-analysen starter, når microarray dias er kemisk blokeret og varer cirka 8 timer. Når startede microarray-analysen er afsluttet (trin 2 til 8).
- Tage mikroarray glider ud af køleskabet, og ækvilibrering dem til stuetemperatur i 30 minutter.
- Fjerne objektglasset fra opbevaringskassen og kortvarigt skyl dem i phosphatpuffersaltopløsning pH 7,2 med 0,1% Tween 20 (PBST0.1) en gang i et objektglas håndvask, og derefter i 15 mM natriumacetatpuffer pH 5,0 med 0,1% Tween (CBT0 0,1) i en sekventiel måde. Inkubér objektglassene i CBT0.1 i 10 minutter i slide håndvask.
- Forbered frisk 150 mM NaIO 4 i 15 mM natriumacetat pH 5,0 (CB), og holde den i ind i et dias håndvask i et køleskab og samtidig undgå lys før brug.
- Fjern dias fra CB, og sætte det ind i bassinet med frisk NaIO 4 med antistoffet sideopad. Omfatte vask med aluminiumfolie for at undgå lys, og inkuber glideren bassinet i 2 timer under forsigtig omrystning ved 4 ° C i et køleskab.
- Fremstille 300 ml af 10 mM hydrazid glutaminsyre (blokerings) i CB.
- Fjern dias fra bassinet, og kort skyl den i CB 3 gange i 5 minutter hver gang i slide håndvask.
- Glassene inkuberes i blokker i en håndvask i 2 timer ved stuetemperatur med forsigtig rystning.
- Fjern dias fra bassinet, og vask dem med PBST0.1 i 3 minutter.
3. Blokere ikke-specifikke bindinger på mikroarrayet med bovint serumalbumin (BSA)
- Fremstille 300 ml af 1% BSA i phosphatbuffer saltvand, pH 7,2 med 0,5% Tween (PBST0.5) i et objektglas håndvask, og inkuber mikroarrayet objektglasset i bassinet i 1 time ved stuetemperatur med forsigtig omrystning.
- Skyl objektglassene i PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver gang.
- Sæt slidepå et objektglas stativ, og centrifugering ved 1200 xg i en centrifugering i 2 minutter for at tørre den mikroarray objektglasset.
4. Imprint Wax Grid på Microarray Slide at adskille de enkelte undergrupperingen
- Forvarmning af voks imprinter ved 70 ° C i 5 minutter.
- Læg den blokerede microarray glide ind i voks imprinter med antistof opad til voks. Træk forsigtigt i håndtaget til aftryk voks på slide jævnt.
5. Anvendelse Serumprøver på mikroarrayet Slide
- Under Trin 2,4, forberede serumprøver for enten Glyco profilering analysen i en prøve (5.1.1), eller en enkelt Glyco epiptope måling blandt flere prøver (5.1.2).
- I et eksperiment for glycan profileringer af multiple serumglycoproteiner i en serumprøve ved hjælp af flere Euros (se eksempel eksperiment 1), vil et serumprøver påføres på alle subarrays. I dette tilfælde er 40 pi serum rigelig fortyndet i 360 ul PBS indeholdende 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml muse IgG, 100 ug / ml rotte IgG, 100 ug / ml kanin-IgG, 100 ug / ml gede-IgG og 100 ug / ml æsel IgG. Denne mængde er tilstrækkelig til at anvende 6 ul fortyndet serum opløsningen på hver undergrupperingen.
- I et eksperiment for den glycan måling af flere serumproteiner mellem flere serumprøver ved anvendelse af en GBP detektioner (se eksempel eksperiment 2). I dette tilfælde er en pi serum rigelig fortyndet i 9 pi PBS indeholdende 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml muse IgG, 100 ug / ml rotte IgG, 100 ug / ml kanin-IgG , 100 ug / ml gede-IgG og 100 ug / ml æsel IgG. Denne mængde er tilstrækkelig til at anvende 6 pi fortyndet serum opløsningen på hver undergrupperingen.
- Efter voks aftryk i trin 4, omhyggeligt gælder 6 pi fortyndet prøve eller kontrolprøver (PBST0.1) til hver undergruppering af dias. Inkuber slæden i en fugtig kassette med våde papirhåndklæder ved stuetemperaturi 1 time.
- Skyl objektglasset med PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver gang.
- Tør dias ved spinding den ved 1200 xg i 2 minutter.
6. Anvend Biotinyleret GBP (Lectin eller Anti-glycan antistof) på Slide
- Under trin 2.4, forbereder 10μg/ml af biotinylerede lectiner / Gbps i PBST0.1.
- I glycan profilering eksperiment som probe én prøve med flere lectiner (prøve eksperiment 1), fremstilling 350 uL af biotinyleret lectin, som er tilstrækkelig for alle subarrays.
- I én glycan epitop / biomarkør screening i multiple prøver ved hjælp af flere lectiner, fremstilles 10 ul af hver biotinyleret lectin, som er tilstrækkelig for en undergruppering.
- Anvendelse 6 pi af fortyndet biotinyleret lectin (er) til hver undergrupperingen af slæden, og inkubér i befugtet objektglasset kassen med våde papirhåndklæder ved stuetemperatur i 1 time.
- Skyl objektglassene med PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver Timig.
- Tør objektglasset ved centrifugering den ved 1200 xg i centrifuge for 2 minutter.
7. Anvendelse farvestofmærkede NeutrAvidin til fluorescenspåvisning
- Forberede 350 pi Dylight 549 mærket NeutrAvidin som er tilstrækkelig for alle subarrays.
- Anvendelse 6 pi Dylight 549 mærket NeutrAvidin på hver undergrupperingen og inkuber glideren i befugtet objektglasset kassetten ved stuetemperatur i 1 time.
- Skyl objektglasset med PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver gang.
- Tør dias ved at dreje den ved 1200 xg i centrifuge i 2 minutter.
8. Få Microarray Slide billede ved at skanne Slide
- Scan dias ved hjælp af en fluorescens microarray scanner på 10 um opløsning. De laser-og PMT-indstillinger skal være så stærk som muligt, men ingen mætning stedet observeres.
9. Dataudtræk og analyse
- Åbn billedet i ArrayPro 3,2. Nedsat arrayet skabelonen ifølge arrayet kort, der viser antistof-spots steder. Omhyggeligt tilpasse hver skabelon cirkel på den tilsvarende sted i billedet.
- Uddrag intensiteten af hver plet i en Excel-fil til yderligere analyse.
10. Repræsentative resultater
Prøven Eksperiment 1
Glykosylering profilering af flere serumglycoproteiner i hepatocellulært carcinom patientserum prøve ved hjælp af kemisk blokeret antistof microarray med flere lektiner detektion.
Formålet med dette eksperiment er at undersøge den individuelle glycosylering profil 20 glycoproteiner i hepatocellulært carcinom (HCC) patientserum prøve ved anvendelse af kemisk blokeret antistof mikroarray med lectin detektion. Et antistof microarray, der indeholder 48 identiske subarrays, som omfatter 26 antistoffer og biotin-BSA, er designet og fremstillet som beskrevet i STEP 1. Disse 26 antistoffer var mod 20 serumglycoproteiner, der er identificeret som lovende tidlig diagnose værdi for HCC patienter ved hjælp af lectin-baseret immunopræcipitation kombineret med massespektrometrisk proteinidentifikation 12, 32 som vist i tabel 1. Mønsteret og arrangementet af de antistof pletter trykkes in triplo i et repræsentativt undergrupperingen er vist i Figur 1E og 1F, hhv. To identiske microarray objektglas, én var ikke kemisk blokeret (fig. 1A), mens den anden blev (figur 1B), blev anvendt til at udføre den samme glycosylering profilering eksperiment for at påvise betydningen af kemisk blokering procedure til analyse. For kemisk blokeret slæde (figur 1B), begyndte eksperimentet ved trin 2, for ingen kemisk blokeret slæde (figur 1A), begyndte eksperimentet fra trin 3. Eksperimentet blev udført ved following alle de skridt, der er beskrevet i protokollen, bortset fra trin 5.1.2 og 6.1.2. I trin 5.2 blev en PBST0.1 kontrolprøve påført subarrays i kolonne 1 og 3, og en samlet HCC serumprøve blev påført subarrays i kolonne 2 og 4, henholdsvis (som vist i figur 1G). Denne sammenligning er at vise effektiviteten af fremgangsmåden, samt antigenbindingsaffinitet af antistofferne efter kemisk blokering. 22 biotinylerede lectiner (som vist i tabel 1), der er specifikke for forskellige glycaner 18, 20 blev anvendt på hver undergrupperingen som vist i figur 1G for glycosylering profilering. Billeder af de kemisk blokeret (fig. 1B) og ikke-kemisk blokeret (fig. 1A) microarrays efter glycosylering-profileringsassay ved at følge protokollen. Som vist i subarrays i kolonne 1 og 3 i ikke-kemisk blokeret mikroarrays (figur 1A og figur 1C), somKun PBST0.1 blev anvendt fleste lectiner bundet til indfangnings-antistoffer og viste meget høj baggrund, der kan sammenlignes med dem subarrays i kolonne 2 og 4, hvor serumprøven blev anvendt. Det er umuligt at få glycan profil oplysninger fra dette microarray dias. Tværtimod, når det samme forsøg blev udført på en kemisk blokeret antistof mikroarray glider de subarrays i kolonne 1 og 3, som kun PBST0.1 blev anvendt fleste lectiner udviste ingen eller meget lav bindinger at indfange antistoffer, mens høj-antigen bindinger blev stadig observeret i subarrays i kolonne 2 og 4, hvor serumprøven blev påført (fig. 1B og 1D). Disse Resultatet viste, at kemisk blokering af proceduren var et afgørende skridt forgrunden måling af glycaner på antistof-tilfangetagne glycoproteiner. Ved at følge protokollen, kan glycosylation profiler af 22 glycoproteiner i HCC serum opnås.
Eksperiment 2
Skærm for ændrede fucosylation på specifikke serumglycoproteiner som biomarkører til diskrimineret levercirrose og hepatocellulært carcinom patienter.
Målet med dette eksperiment er at screene for ændret fucosylering om bestemte serumglycoproteiner som biomarkører, som diskriminerer levercirrose og hepatocellulært carcinom (HCC) patienter. Forskellig fra eksperiment 1, hvori kun én serumprøve blev anbragt på hver subarrays og probet med forskellige lektiner, i dette assay, i alt 40 forskellige serumprøver fra HCC og cirrhose patienter blev påført hver undergrupperingen og probet med et lectin (AAL ). Statistisk analyse, såsom T-test, modtager-operating characteristic (ROC) kurve, blev udført for at evaluere fordelingerne eller diagnostisk ydeevne glycan epiptope / biomarkør for hvert enkelt protein i alle serumprøver. Vi anvendte det samme antistof mikroarray fremstillet i forsøg 1, bortset fra anti-CA19-9-og anti-Lewis X-antistoffer i denne undersøgelse. Den ekspertiseiment blev gennemført fra september 2 til trin 9 med undtagelse af Step 5.1.1 og 6.1.1. I alt 40 serumprøver fra 20 skrumpelever og 20 HCC patienter blev anvendt tilfældigt undergrupperingen af de 48 subarrays sammen med de kontrol PBS prøver som negativ kontrol. Fucosylering af hver af de indfangede proteiner blev derefter detekteret ved hjælp af biotinyleret Fucose-specifik lectin. Mikroarrayet billede vist i figur 1 viste lectin AAL kun bundet til serumproteiner fanget på mikroarrayet (fig. 2D) i stedet for indfangede antistoffer (figur 2E). AAL bindende intensiteter af alle de steder blev derefter ekstraheret, og analyseres ved hjælp af T-test og ROC kurver at evaluere resultaterne af fucosylering (AAL binding intensitet) af hvert serum protein på forskelsbehandling mellem HCC og skrumpelever grupper. Resultaterne viste, at fucosylering af GP73 protein gav den bedste forskelsbehandling mellem de to grupper med en p = 0,03 og areal-under-kurve ROC-kurven er lig med 0,72. Dette eksperiment viste denne fremgangsmåde er en hurtig, effektiv fremgangsmåde til glycan epitop / biomarkør screening af flere prøver i adskillige proteiner.
ID | Navn på reagenset | Forkortelse | Firma | Katalog # |
L1 | Biotinyleret Concanavalin A | ConA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L2 | Biotinyleret Sambucus nigra Lectin | SNA | Vector Laboratories | B-1305 |
L3 | Biotinyleret Lens culinaris agglutinin | LCA | Vector Laboratories | BK-2000 |
L4 | Biotinyleret Ricinus communis agglutinin I | RCA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L5 | Biotinyleret Aleuria Aurantia Lectin | AAL | Vector Laboratories | B-1395 |
L6 | Biotinyleret Erythrina Cristagalli Lectin | ECL | Vector Laboratories | BK-3000 |
L7 | Biotinyleret Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lectin II | GSL II | Vector Laboratories | BK-3000 |
L8 | Biotinyleret hvedekimagglutinin | WGA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L9 | Biotinyleret Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | PHA-E | Vector Laboratories | BK-2000 |
L10 | Biotinyleret Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | PHA-L | Vector Laboratories | BK-2000 |
L11 | Biotinylated jordnøddeagglutinin | PNA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L12 | Biotinyleret Pisum sativum agglutinin | PSA | Vector Laboratories | BK-2000 |
L13 | Biotinyleret Dolichos Biflorus agglutinin | DBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L14 | Biotinyleret Datura stramonium Lectin | DSL | Vector Laboratories | BK-3000 |
L15 | Biotinyleret Sophora Japonica agglutinin | SJA | Vector Laboratories | BK-2000 |
L16 | Biotinyleret Soybean agglutinin | SBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L17 | Biotinyleret Solanum tuberosum (Kartoffel) Lectin | STL | Vector Laboratories | BK-3000 </ Td> |
L18 | Biotinyleret Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lectin I | GSL jeg | Vector Laboratories | BK-2000 |
L19 | Biotinyleret Vicia villosa Lectin | VVL | Vector Laboratories | BK-2000 |
L20 | Biotinyleret Lycopersicon esculentum (Tomat) Lectin | LEL | Vector Laboratories | BK-3000 |
L21 | Biotinyleret Ulex Europaeus agglutinin jeg | UEA jeg | Vector Laboratories | BK-1000 |
L22 | Biotinyleret brødfrugt | Brødfrugt | Vector Laboratories | BK-3000 |
A1 | Ged F (ab ') 2 fragment-anti-humant IgM, Fc5μ antistof | IgM | Jackson Immuno Research | 109-006-129 |
A2 | Æsel F (ab ') 2Frag-anti-humant IgG (H + L)-antistof | AB1 | Jackson Immuno Research | 709-006-149 |
A3 | Muse anti-human IgG F (ab ') 2 monoklonalt antistof | ÆB3 | Jackson Immuno Research | 209-005-097 |
A4 | Gede-anti-humant alpha 2 macroglobulin polyklonalt antistof | A2m | GeneTex | GTX62924 |
A5 | Kanin-anti-humant alpha-1-antitrypsin-polyklonalt antistof | A1AT | Lee Biosiences | CA1T-80A |
A6 | Muse anti-human alpha-1-antitrypsin-monoklonalt antistof | A1AT | Sigma Aldrich | SAB4200198 |
A7 | Kanin-anti-humant alpha-1-antitrypsin-polyklonalt antistof | ACT | NeoMarkers | RB-367-A1 |
A8 | Kanin-anti-humant alpha-1-antichymotrypsin polyklonalt antistof | ACT | Fisher Scientific | RB9213R7 |
A9 | Muse anti-human transferrin monoklonalt antistof | Transferrin | GeneTex | GTX101035 |
A10 | Kanin-anti-humant transferrin polyklonalt antistof | Transferrin | GeneTex | GTX77130 |
A11 | Gede-anti-humant apolipoprotein J polyklonalt antistof | ApoJ | Abcam | ab7610 |
A12 | Muse anti-human GP73 monoklonalt antistof | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
A13 | Muse anti-human GP73 monoklonalt antistof | GP73 | Santa Cruz Biotechnology INC | sc-101.275 |
A14 | Kanin-anti-humant alpha-føtoprotein en polyklonalt antistof | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
A15 | Muse anti-human alpha-1 føtoprotein monoklonalt antistof | AFP | Fitzgerald | 10-A05A |
A16 | Muse anti-human hæmopexin monoklonalt antistof | Hæmopexin | Assaypro | 60190-05011 |
A17 | Muse anti-human glypican-3 (1G12) monoklonalt antistof | GPL3 | Santa Cruz Bio | sc-65.443 |
A18 | Muse anti-human kininogen (LMW) monoklonalt antistof | Kininogen | Assaypro | 20333-05011 |
A19 | Kanin-anti-human MMP-21 monoklonalt antistof | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
A20 | Muse anti-human CEACAM-1 monoklonalt antistof | CEACAM | R & D Systems | MAB1180 |
En21 | Rotte-anti-humant DPPIV/CD26 monoklonalt antistof | DPPIV | R & D Systems | MAB22441 |
A22 | Muse anti-human Pivka II monoklonalt antistof | PIVICA | Crystal kemi | 8040 |
A23 | Muse anti-carcinoembryonisk antigen | CEA | USA biologiske | C1300 |
A24 | Muse-anti-CA125 cancerantigen | CA125 | USA biologiske | C0050-01D |
A25 | Muse-anti-CA19-9 cancerantigen | CA19-9 | USA biologiske | C0075-18 |
A26 | Muse-anti-Lewis X-monoklonalt antistof | Lewis X | Calbiochem | 434631 |
bio | Biotinyleret BSA (positiv kontrol) | Bio | Hjem-made | N / A |
Tabel 1. Liste over lectiner og antistoffer, der anvendes i denne protokol.
Reagensets navn, s / udstyr | Firma | Katalog nummer |
Ikke kontakt microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
384 mikrotiterplade | Fisher | 14-230-243 |
FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
Ultratynde nitrocellulose coate microarray glider | Gentel | PATH |
Slide Imprinter (valgfrit) | Gelen Company | WSP60-1 |
Shaker | Fisher | 15-453-211 |
Centrifuger | Eppendorf | 5804 000.013 |
Skub håndvask / Slide farvning Dish with Aftagelig Rack | Fisher | 08-812 |
Objektglas rugekammeret / mikroskoppræparatglas box | Fisher | 03-448-5 |
Brij 35, 30% w / v opløsning i vand | Acros Organics | AC32958-0025 |
Tween-20 | Fisher | P337-100 |
Natriumperiodat (NalO4) | Sigma | 311448 |
L-glutaminsyre γ-hydrazid | Sigma | G-7257 |
Natriumacetat Vandfri (CH3COONa) | Sigma | S2889 |
Bovint serumalbumin (BSA) | Lampire Biologisk Labs | 7500804 |
Phosphatpuffersaltopløsning (PBS) (10X) | Denville Videnskabelige | CP4390-48 |
Dylight 549 konjugeret NeutrAvidin | Thermo | 22837 |
Proteaseinhibitor-cocktail Tabletter | Roche | 4693159001 |
ChromPure Humant IgG, Fc-fragmentet | Jackson Immunoresearch | 009-000-008 |
ChromPure Humant IgG, helt molekyle | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 |
ChromPure mus IgG, helt molekyle | Jackson Immunoresearch | 015-000-003 |
ChromPure mus IgG, Fc-fragmentet | Jackson Immunoresearch | 015-000-008 |
ChromPure kanin IgG, helt molekyle | Jackson Immunoresearch | 011-000-003 |
ChromPure Donkey IgG, helt molekyle | Jackson Immunoresearch | 017-000-003 |
Microarray Scanner | Tecan | LS Reloaded |
Tabel 2 nedenfor. Listaf udstyr og reagenser, der anvendes i denne protokol.
Skema 1 En ordning viser lectin antistoffet mikroarray baseret glycan biomarkør opdagelse fremgangsmåde 1 (Trin 2 til 4): Blokering af antistoffet mikroarray med blokker (Glu-hydrazid) og BSA, 2 (trin 5).. Anvendelse serumprøver og indfange specifikke glycoproteiner med specifikke antistoffer, 3 (Trin 6): anvendelse biotinyleret lectin (er), 4 (trin 7): Probe det biotinylerede AAL med Dylight 549 mærket NeutrAvidin for mikroarray billeddannelse.
Figur 1. Microarray billeder af prøven Eksperiment 1 glycosylering profilering af multiple serumglycoproteiner i HCC patient serumprøve ved hjælp chemicallierede blokeret antistof mikroarray med multiple lectin detektion. To identiske microarray objektglas (A) ingen kemisk blokeret eller (B) kemisk blokeret som beskrevet i trin 2, begge gik gennem alle trin fra 2 til 9 til glycosylering profilering samt sammenligningsformål. (A) og (B) er microarray billederne scannes på trin 8 i en opløsning på 10 mikron. (C) zoom i billedet af de to første rækker af ingen kemisk blokeret microarray slide (A), (D) zoom i billedet af de to første rækker ikke kemisk blokeret microarray slide (B)), (E) diagrammet af antistoffet arrangementet i hvert undergrupperingen (f) array kort: placeringen af hvert antistof i undergrupperingen, hvert antistof navn repræsenterer 3 pletter (G) serumprøve og lectin placering: Et diagram viser, hvilke undergrupperingen hver serumprøve og lectin blev påført på.
Figur 2. Microarray billeder afPrøven eksperiment 2 skærm til ændret fucosylering om bestemte serumglycoproteiner som biomarkører, som diskriminerer levercirrose og HCC patienter. Mikroarrayet Assayet blev udført som beskrevet i Eksempel Eksperiment 2 sektion. (A) Hele lysbillede af mikroarray objektglasset fra trin 8 (B) diagram af antistoffet arrangementet i hvert undergrupperingen, (C) array-kort: placeringen af hvert antistof i undergrupperingen, hvert antistof navn repræsenterer 3 pletter; (D) en zoom-in billede af en undergruppering der blev inkuberet med serum-prøve (E) en zoom-in billede af en undergruppering der blev inkuberet med PBS-kontrol.
Figur 3. Glycan profilanalyser fra prøven eksperiment 1. Hver søjlegraf repræsenterer lectin binding profil (eller glycan profiler) ifølge et af de 20 testede protein. Alt 22 forskellige lectiner blev benyttet til at analysere the glycan profil af hvert protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Target protein og capture Antibody Selection
Forud for antistoffet mikroarray assayet nogle reagenser og materialer for at blive betragtet og fremstilles. At designe et antistof microarray for glycan profilering eller glycan biomarkør screening, et panel af antistoffer specifikke for glycoprotein ansøgere skal fastlægges i henhold til litteraturen eller fra tidligere resultater. Disse antistoffer var normalt købt fra forskellige leverandører, såsom R & D Systems mv IgG foretrækkes indfangningsantistoffer forhold til vores tidligere tests viste, at nogle IgM og IgE helt kan miste deres antigen bindingsaffiniteter efter kemisk modifikation.
2. Design og fremstilling af antistof microarray
Fremstilling af antistoffet microarray er et valgfrit trin, som kræver professionel og dyre microarrayer, og vel-uddannet personale til drift. Men tilpasset antistof microarray fremstiltur kan let udføres fra en tjenesteudbyder, såsom Serome Biosciences Inc. For en robust resultat, anbefales en berøringsfri microarrayer, såsom Scienion sciFLEXARRAYER ultralav volumen berøringsfri microarrayer der blev anvendt i vores antistof mikroarray fremstilling. Høj bindingskapacitet microarray lysbilleder, såsom PATH (Gentel Bio Inc. WI) eller Slide H (Shott, PA).
3. Vælg og Forbered glycan proteiner (Gbps) for glycosylering profilering
Euros målet forskellige mono-eller oligosaccharider kan findes i litteraturen og gennem en søgemaskine udviklet af Haab laboratoriet 29 og holdes på det translationelle Genomics Institute At vælge Euros med høj specificitet og affinitet tilde målrettede glycan epitoper, vælge motiv (epitop) fra drop down menuen, og klik på "søg". Den Euros specifikke for dette motiv (epitop) vil blive opført i henhold til deres logP værdi fra høj til lav orden. Højere logP angiver en stærkere bindingsaffinitet og specificitet til glycan motiv / epitop. Grund af den iboende ikke-specifik binding emne fra lectin, er denne fremgangsmåde stadig ikke så optimalt som antistoffet assay. Derfor anbefaler vi, at anti-glycan antistoffer anvendes, såsom anti-Lewis X eller anti-sialyl Lewis nogle antistoffer, hvis de er tilgængelige. Anvendelse af flere Euros for detektion er en anden strategi til at krydstjekke forskellige bindende profiler og for at få pålidelige bindende data.
4. Dataanalyse
Fordi denne fremgangsmåde anvendes til at detektere native serumproteiner, kan protein-protein-komplekser kan indfanges og detekteres. Western blot eller massespektrometri er gode metoder at validere microarray data. I mellemtiden, Detektion af protein-niveauer ved hjælp af samme mikroarray er en anden metode til at lære detaljerne i glycosylering ændring af proteinet, såsom hvorvidt ændringer var på grund af det totale proteinindhold ændring eller blot at glycosylering niveau forøges på hver af proteinerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Institut for hepatitis og Virus Research.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biotinylated Concanavalin A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA |
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
Biotinylated Peanut Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA |
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
Biotinylated Datura Stramonium Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
Biotinylated Soybean Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
Biotinylated Vicia Villosa Lectin | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
Biotinylated Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 | JACALIN |
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody | GeneTex | GTX62924 | A2M |
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | Lee Biosiences | CA1T-80A | A1AT |
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | NeoMarkers | RB-367-A1 | ACT |
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody | GeneTex | GTX101035 | Transferrin |
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody | GeneTex | GTX77130 | Transferrin |
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody | Abcam | ab7610 | ApoJ |
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody | Assaypro | 60190-05011 | Hemopexin |
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody | Crystal chem | 8040 | PIVICA |
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen | US biological | C1300 | CEA |
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen | US biological | C0050-01D | CA125 |
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen | US biological | C0075-18 | CA19-9 |
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
Biotinylated BSA (positive control) | Home-made | N/A | Bio |
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol. | |||
Non contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
384 microplate | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides | Gentel | PATH | |
Slide Imprinter (optional) | The Gel Company | WSP60-1 | |
Shaker | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 000.013 | |
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
Slide incubation chamber/microscope slide box | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
Brij 35, 30 w/v% solution in water | Acros Organics | AC32958-0025 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
Sodium Periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
L-Glutamic acid γ-hydrazide | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Group | 4693159001 | |
ChromPure Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
ChromPure Mouse IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
ChromPure Donkey IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
Microarray Scanner | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol. |
References
- Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
- Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
- Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
- Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
- Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
- Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
- Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
- Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
- Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
- Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
- Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
- Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
- Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
- Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
- Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
- Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
- Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
- Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
- Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
- Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
- Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
- Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
- Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
- Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
- Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
- Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
- Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
- Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
- Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
- Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
- Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).