Summary
Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.
Protocol
1. Test için bir antikor Mikroarray yazdırmak
- 0.5 mg / fosfat tampon salin, ph 7.2 (PBS) içinde ml tüm antikorları ile seyreltilir.
- 384 kuyucuklu kaynak plakasına alikotu her antikor 40 ul.
- Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer üzerine 384-iyi kaynak plaka yükleyin.
- Hedef olarak microarrayer üzerine 20 PATH mikroarray slaytlar yükleyin.
- 27 antikorları ve kontrol proteinler 9x9 modeli (Şekil 1E, 1F) olarak üç nüsha olarak tespit edildiği 48 özdeş Altdizilim, yazdırmak için microarrayer ayarlayın.
- Antikor mikroarray slaytları yazdırmak için microarrayer başlayın.
- Antikor mikroarray slaytlar toplayın ve kurutucu ile slaytlar kaset saklayın. Vakum kesme (Foodsaver) kullanarak plastik bir torbaya kaset mühür temizleyin.
- 4 ° C'de buzdolabında kapalı mikroarray slaytlar saklayın.
2. Kimyasal GBP Önlemek için Antikor Mikroarray engelleYakalama Antikorlar bağlanarak
Mikroarray testi mikroarray slaytlar kimyasal engellenen bir kez başlar ve yaklaşık 8 saat sürer. Bir kez mikroarray assay tamamlanması için olan açtığı (Basamak 2-8).
- Mikroarray buzdolabı kayarak atın ve 30 dakika oda sıcaklığında onları dengeye.
- % 0.1 Tween (CBT0 ile 15 mM sodyum asetat tamponu pH 5.0, sonra saklama kutusundan slayt çıkarın ve kısaca havzası yıkama slayt kez% 0.1 Tween 20 (PBST0.1) ile fosfat buffer salin pH 7.2 bunları temizleyin, durulayın ve .1) sıralı bir şekilde. Slayt yıkama havzasında 10 dakika CBT0.1 slaytları inkübe edin.
- 15 mM sodyum asetat tamponu pH 5.0 (CB) taze 150 mM NaIO 4 hazırlayın ve kullanılmadan önce hafif kaçınarak buzdolabında lavabo çamaşır slayt halinde saklayın.
- CB slayt çıkarın ve antikor yan taze NaIO 4 içeren havza içine koyduyukarı bakacak. Işık önlemek ve nazik bir buzdolabında 4 ° C'de çalkalanarak 2 saat slayt havza inkübe için alüminyum folyo ile havza örtün.
- CB'de 10 mM hidrazit glutamik asit (engelleyici), 300 mL hazırlayın.
- Havzasından slayt çıkarın ve kısaca 3 kez 5 dakika slayt yıkama havzasında her zaman için CB durulayınız.
- Nazik bir çalkalama ile oda sıcaklığında 2 saat için bir çamaşır havzasında bloker slaytları inkübe.
- Havzasından slaytlar çıkarın ve 3 dakika PBST0.1 ile yıkayın.
3. Bovine Serum Albumin ile Mikroarray özgü olmayan Bağlar engelleme (BSA)
- Slayt çamaşır havzasında% 0.5 Tween (PBST0.5) ile fosfat tampon tuzlu pH 7,2% 1 BSA 300 ml hazırlayın ve hafifçe sallayarak oda sıcaklığında 1 saat havzasında mikroarray slayt inkübe.
- 3 dakika için her seferinde üç kez PBST0.1 slaytları çalkalayın.
- Slayt koyunmikroarray slayt kuruması için 2 dakika santrifüj üzerine 1200 xg'de bir slayt raf ve dönüşlerde.
4. Her altdizilim ayırın için Mikroarray Slayt üzerine Künye Wax Izgara
- 70 de balmumu imprinter ön-ısıtma 5 dakika boyunca ° C.
- Balmumu bakan antikor yüzü balmumu imprinter içine bloke mikroarray slayt yükleyin. Yavaşça eşit slayt üzerine künye balmumu kolu çekin.
5.. Mikroarray Slayt üzerine Serum Örnekleri Uygula
- Adım 2.4 sırasında birden fazla numune (5.1.2) arasında bir örnekte gliko profilleme assay (5.1.1), veya tek gliko epiptope ölçümü ya da serum numuneleri hazırlamak.
- Birden fazla Gbps (Örnek Deney 1 bakınız) kullanılarak bir serum numunesi içinde birden çok serum glikoproteinleri glukanıdır profilings için bir deneyde, bir serum numuneleri, tüm Altdizilim üzerine tatbik edilir. Bu durumda, 40 ul serumu içeren geniş bir 0.1% 360 ul PBS içinde seyreltilirTween-20,% 0.1 Brij 35, 100 ug / fare IgG, 100 ug / sıçan IgG mL, 100 ug / tavşan IgG, 100 ug / mL keçi IgG ve 100 ug / ml eşek IgG mL mL. Bu birim her altdizilim üzerine sulandırılmış serum solüsyonu 6 ul uygulanması için yeterlidir.
- Bir GBP tespitlerde (örnek deney 2) kullanarak birden serum örnekleri arasında birden fazla serum protein bir glukanıdır ölçümü için bir deneyde. Bu durumda, 1 ul PBS serum yeterli içeren% 0.1 arasında 9 ul içinde seyreltilir Tween-20,% 0.1 Brij 35, fare IgG, 100 ug / sıçan IgG mL, 100 ug / tavşan IgG mL 100 ug / ml , 100 ug / keçi IgG ve 100 ug / eşek IgG mL mL. Bu birim her altdizilim üzerine sulandırılmış serum solüsyonu 6 uL uygulanması için yeterlidir.
- Adım 4 balmumu atama, dikkatli bir slayt her altdizilim seyreltilmiş numuneye veya kontrol örneklerinin 6 uL (PBST0.1) uyguladıktan sonra. Oda sıcaklığında ıslak kağıt havlu ile nemlendirilmiş bir kaset slayt inkübe1 saat karıştırıldı.
- 3 dakika için her seferinde üç kez PBST0.1 ile kayar çalkalayın.
- 2 dakika için 1200 xg'de dönerken tarafından slayt kurulayın.
6. Slayt üzerine tinile YTL (lektin veya Anti-glikan Antikor) uygulayın
- Adım 2.4 sırasında, PBST0.1 yılında biyotinile lektinler / Gbps 10μg/ml hazırlamak.
- Glukanıdır profilleme deneyde birden lektinler ile prob bir örnek (numune deney 1), tüm Altdizilim için yeterlidir biyotinile lektin 350 uL hazırlamak olduğunu.
- Birden lektinler kullanarak birden çok örneklerinde tek glukanıdır epitop / biyomarker tarama, bir altdizilim için yeterli olduğunu, her biyotinile lektin 10 ul hazırlamak.
- Sürgünün her altdizilim ile seyreltilmiş biyotinile lektin (ler) in 6 uL uygulamak ve 1 saat için oda sıcaklığında ıslak kağıt havlu ile nemlendirilmiş kayar kutusuna inkübe edilir.
- 3 dakika her ti için PBST0.1 üç kez slaytlar durulayınbana.
- 2 dakika santrifüj 1200 xg'de dönerken tarafından slayt kurulayın.
7. Floresan Algılama için Boya Etiketli NeutrAvidin Uygula
- Tüm Altdizilim için yeterlidir Dylight 549 etiketli NeutrAvidin 350 uL hazırlayın.
- Her altdizilim üzerine Dylight 549 etiketli NeutrAvidin 6 uL uygulamak ve 1 saat için oda sıcaklığında nemlendirilmiş kayar kaset kayar inkübe edilir.
- 3 dakika için her seferinde üç kez PBST0.1 ile kayar çalkalayın.
- 2 dakika santrifüj 1200 xg'de dönerken tarafından slayt kurulayın.
8. Slayt Tarama tarafından Mikroarray Slayt Resim edinin
- 10 mikron çözünürlükte bir floresan mikroarray tarayıcı kullanarak slayt tarayın. Lazer ve PMT ayarları mümkün olduğu kadar kuvvetli olması gerekir, ancak hiçbir yerinde doygunluk görülmektedir.
9. Veri çıkarımı ve Analiz
- ArrayPro 3.2 resim açın. Antikor noktalar konumları gösteriyor dizi haritaya göre dizi şablon ayarlama. Dikkatlice görüntüsünde karşılık gelen nokta üzerine her şablon daire hizalayın.
- Daha fazla analiz için bir Excel dosyası içine her yerinde şiddeti ayıklayın.
10. Temsilcisi Sonuçlar
Örnek Deney 1
Birden fazla lektinler algılama ile kimyasal bloke antikor mikroarray kullanarak hepatosellüler karsinom hasta serum örneğinde birden fazla serum glikoproteinleri glikozilasyonu profilleme.
Bu denemenin amacı, lektin algılama ile kimyasal olarak bloke antikor mikroarray ile hepatoselüler karsinom (HCC) hasta serum örneğinde 20 glikoproteinler bireysel glikozilasyon profilini ortaya koymaktır. S açıklandığı gibi 26 antikor ve biyotin-BSA dahil 48 özdeş Altdizilim içeren bir antikor mikroarray, tasarlanmış ve imal edildi1 Tep. Bunlar, 26 antikorları Tablo 1 'de gösterildiği gibi kütle spektrometrik proteini tanımlama 12, 32 ile birleştirilmiş lektin bazlı immünopresipitasyon kullanılarak HCC hastalar için erken teşhis değeri sözü olarak tanımlanan 20 serum glikoproteinleri karşı edildi. Bir temsilci alt dizisinde üç nüsha basılmış antikor lekelerin desen ve düzenleme sırasıyla Şekil 1E ve 1F gösterilmiştir. Diğer bir (Şekil 1B), analiz için kimyasal olarak bloke prosedürü önemini göstermek için aynı glikozilasyon profil deneyi yürütmek için kullanılan iken iki özdeş mikroarray kaydırak, bir kimyasal olarak, (Şekil 1A) bloke değildi. Kimyasal olarak bloke slayt (Şekil 1B) için, deneme Adım 2 başlayan; hiçbiri kimyasal bloke slayt (Şekil 1A) için, deney Adım 3 başladı. Deney followin tarafından gerçekleştirilmiştirg Adım 5.1.2 ve 6.1.2 dışında protokolü açıklanan tüm adımları. Basamak 5.2 'de, bir PBST0.1 kontrol örneği kolon 1 ve 3'te Altdizilim üzerine tatbik edildi ve bir havuza HCC serum numunesi (Şekil 1 G gösterildiği) sütunu 2 ve 4, sırasıyla, in Altdizilim üzerine uygulandı. Bu karşılaştırma kimyasal olarak engelleme etkinliği sonra, işlem verimi yanı sıra antikor antijen bağlanma afiniteleri göstermektir. Glikozilasyon profil için Şekil 1 G 'de gösterildiği gibi, farklı glukanlardır 18, 20 özgü her altdizilim üzerine tatbik edildi olduğu 22 biyotinile lektinler (Tablo 1 içinde gösterildiği gibi). Protokolü izleyerek glikozilasyon profil testi sonra kimyasal olarak bloke (Şekil 1B) ve non-kimyasal olarak bloke (Şekil 1A) microarrays Görüntüler. Gibi non-kimyasal olarak bloke mikroarray'ler (Şekil 1A ve Şekil 1C), sütun 1 ve 3'te gösterilen Altdizilim hangiSadece PBST0.1 en lektinler antikorlar yakalamak için bağlı, uygulanır ve serum numunesi başvurusu yapılan sütun 2 ve 4, olanlar Altdizilim bu karşılaştırılabilir çok yüksek arka gösterdi. Bu mikroarray slayttan glukanıdır profil bilgileri elde etmek mümkün değildir. Tam tersine, aynı deney, bir kimyasal olarak bloke antikoru mikroarray kayar üzerinde yapıldı olduğunda, kolon 1 ve sadece PBST0.1 uygulanmıştır hangi 3, in Altdizilim, en lektinler antikorlar yakalamak için hiç ya da çok düşük bağları gösterdi; süre yüksek antijen bağları hala serum örneği (Şekil 1B ve 1D) uygulanan yapıldığı, sütun 2 ve 4 Altdizilim gözlendi. Bu sonuç, kimyasal olarak bloke prosedürü antikoru-tutsak glikoproteinleri üzerine glukanlardır ölçümü öne kritik bir adım olduğunu gösterdi. Protokolü takip edilerek, HCC serum 22 glikoproteinlerinin glikozilasyon profilleri elde edilebilir.
Deney 2
Değişmiş fucos için ekranayrımcılık siroz ve karaciğer kanseri hastalara biyolojik olarak spesifik serum glikoproteinler üzerine ylation.
Bu denemenin amacı, karaciğer sirozu ve hepatoselüler karsinom (HCC) hasta ayrımcılık biyolojik olarak spesifik serum glikoproteinler üzerine değişmiş fucosylation için ekran etmektir. Bu testte sadece bir serum örneği her Altdizilim üzerine uygulanır ve çeşitli lektinler ile probed edildiği Deney 1,,, HCC ve siroz hastalarının toplam 40 farklı serum örneklerinde farklı her altdizilim üzerine uygulanır ve bir lektin (AAL ile probed edildi ). Böyle T testi, alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi gibi istatistiksel analiz, dağılımları veya tüm serum örneklerinde her protein glukanıdır epiptope / biyomarker tanısal performansını değerlendirmek amacıyla yapıldı. Bu çalışmada, anti-CA19-9 ve anti-Lewis X antikorları dışında Deney 1 imal aynı antikoru mikroarray kullanılır. Experiment Adım 5.1.1 ve 6.1.1 dışında Adım 9 Eylül 2 den gerçekleştirildi. Toplam 20 siroz 40 serum numuneleri ve 20 HCC hastaları negatif kontrol olarak kontrol PBS örnekleri ile birlikte 48 Altdizilim rastgele altdizilim de uygulanmıştır. Her yakalanan proteinlerin Fucosylation sonra biyotinile fucose spesifik lektin kullanılarak tespit edildi. Şekil 1 de gösterildiği mikroarray görüntü yerine yalnızca yakalanan antikorların mikroarray (Şekil 2B) (Şekil 2E) üzerinde yakalandı serum proteinlerine lektin AAL göstermiştir. Tüm lekelerin AAL bağlayıcı şiddetleri sonra ayıklanır ve HCC ve siroz gruplar arasında ayrımcılık her serum protein fucosylation (AAL bağlayıcı yoğunluğu) performansını değerlendirmek için T testi ve ROC eğrileri kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar GP73 protein fucosylation bir p = 0.03 iki grup ayrımını en iyi veren ve alan-under-gösterdiROC eğrisi eğrisi 0.72 eşittir. Bu deney, bu prosedür çoklu proteinlerden içinde birden çok örnekleri üzerinde glukanıdır epitop / biyomarker tarama için hızlı, etkili bir yöntemdir gösterdi.
| Kimlik | Reaktif Adı | Kısaltma | Şirket | # Kataloğa |
| L1 | Biyotinile Concanavalin A | ConA | Vektör Laboratuvarları | BK-1000 |
| L2 | Tinile Sambucus Nigra Lektin | SNA | Vektör Laboratuvarları | B-1305 |
| L3 | Tinile Lens Culinaris Aglütinin | LCA | Vektör Laboratuvarları | BK-2000 |
| L4 | Ricinus Communis Aglütinin Ben biyotinile | RCA | Vektör Laboratuvarları | BK-1000 |
| L5 | Tinile Aleuria Aurantia Lektin | AAL | Vektör Laboratuvarları | B-1395 |
| L6 | Tinile Erythrina Cristagalli Lektin | ECL | Vektör Laboratuvarları | BK-3000 |
| L7 | Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin II | GSL II | Vektör Laboratuvarları | BK-3000 |
| L8 | Tinile buğday tohumu Aglütinin | WGA | Vektör Laboratuvarları | BK-1000 |
| L9 | Tinile Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | PHA-E | Vektör Laboratuvarları | BK-2000 |
| L10 | Tinile Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | PHA-L | Vektör Laboratuvarları | BK-2000 |
| L11 | Biotinylated Fıstık Aglütinin | PNA | Vektör Laboratuvarları | BK-1000 |
| L12 | Pisum Sativum Aglütinin biyotinile | PSA | Vektör Laboratuvarları | BK-2000 |
| L13 | Tinile Dolichos tohumları biflorus Aglütinin | DBA | Vektör Laboratuvarları | BK-1000 |
| L14 | Tinile Datura stramonium Lektin | DSL | Vektör Laboratuvarları | BK-3000 |
| L15 | Tinile Sophora Japonica Aglütinin | SJA | Vektör Laboratuvarları | BK-2000 |
| L16 | Tinile Soya Aglütinin | SBA | Vektör Laboratuvarları | BK-1000 |
| L17 | Tinile Solanum Tuberosum (Patates) Lektin | STL | Vektör Laboratuvarları | BK-3000 </ Td> |
| L18 | Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin I | GSL I | Vektör Laboratuvarları | BK-2000 |
| L19 | Tinile Vicia villosa Lektin | VVL | Vektör Laboratuvarları | BK-2000 |
| L20 | Tinile Lycopersicon esculentum (Domates) Lektin | LEL | Vektör Laboratuvarları | BK-3000 |
| L21 | Tinile Ulex europaeus Aglütinin I | UEA I | Vektör Laboratuvarları | BK-1000 |
| L22 | Biyotinile Jacalin | JACALIN | Vektör Laboratuvarları | BK-3000 |
| A1 | Keçi F (ab ') 2 Fragment anti-insan IgG, Fc5μ antikoru | IgM | Jackson Immuno Araştırma | 109-006-129 |
| A2 | Eşek F (ab ') 2Frag anti-insan IgG (H + L) antikoru | AB1 | Jackson Immuno Araştırma | 709-006-149 |
| A3 | Fare anti-insan IgG F (ab ') 2 monoklonal antikor | AB3 | Jackson Immuno Araştırma | 209-005-097 |
| A4 | Keçi anti-insan alfa 2 makroglobulin poliklonal antikor | A2M | GeneTex | GTX62924 |
| A5 | Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor | A1AT | Lee Biosiences | CA1T-80A |
| A6 | Fare anti-insan alfa-1-antitripsin monoklonal antikor | A1AT | Sigma Aldrich | SAB4200198 |
| A7 | Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor | ACT | Boyandı | RB-367-A1 |
| A8 | Tavşan anti-insan alfa-1-antikhymotrypsin poliklonal antikor | ACT | Fisher Scientific | RB9213R7 |
| A9 | Fare anti-insan transferin monoklonal antikor | Transferrin | GeneTex | GTX101035 |
| A10 | Tavşan anti-insan transferin poliklonal antikor | Transferrin | GeneTex | GTX77130 |
| A11 | Keçi anti-insan apolipoprotein J poliklonal antikor | APOJ | Abcam | ab7610 |
| A12 | Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
| A13 | Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor | GP73 | SANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİ A.Ş. | sc-101.275 |
| A14 | Tavşan anti-insan alfa-1 fetoprotein poliklonal antikor | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
| A15 | Fare anti-insan alfa-1 fetoprotein monoklonal antikor | AFP | Fitzgerald | 10-A05A |
| A16 | Fare anti-insan hemopexin monoklonal antikor | Hemopexin | Assaypro | 60190-05011 |
| A17 | Fare anti-insan glypican-3 (1G12) monoklonal antikor | GPL3 | Santa Cruz Bio | sc-65.443 |
| A18 | Fare anti-insan Kininogen (LMW) monoklonal antikor | Kininogen | Assaypro | 20333-05011 |
| A19 | Tavşan anti-insan MMP-21 monoklonal antikor | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
| A20 | Fare anti-insan CEACAM-1 monoklonal antikor | CEACAM | R & D Systems | MAB1180 |
| A21 | Sıçan anti-insan DPPIV/CD26 monoklonal antikor | DPPIV | R & D Systems | MAB22441 |
| A22 | Fare anti-insan PIVKA II monoklonal antikor | PIVICA | Kristal chem | 8040 |
| A23 | Fare anti-karsinoembriyonik antijen | CEA | ABD biyolojik | C1300 |
| A24 | Fare anti-CA125 Kanser Antijen | CA125 | ABD biyolojik | C0050-01D |
| A25 | Fare anti-CA19-9 Cancer antijeni | CA19-9 | ABD biyolojik | C0075-18 |
| A26 | Fare anti-Lewis x monoklonal antikor | Lewis X | Calbiochem | 434631 |
| bio | Tinile BSA (pozitif kontrol) | Bio | Ev yapımı | N / A |
Bu protokolde kullanılan lektinler ve antikorların Tablo 1. Listesi.
| Reaktif s / ekipmanları Adı | Şirket | Katalog numarası |
| Temassız microarrayer | BioDot A.Ş. | sciFLEXARRAYER |
| 384 mikroplaka | Balıkçı | 14-230-243 |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
| Ultrathin nitroselüloz coate mikroarray slaytlar | Gentel | PATH |
| Slayt Damgalayıcı (isteğe bağlı) | Jel Şirket | WSP60-1 |
| Shaker | Balıkçı | 15-453-211 |
| Santrifüj | Eppendorf | 5804 000.013 |
| Havza / Slayt Boyama Bulaşık yıkama wi kaydırınth Çıkarılabilir Raf | Balıkçı | 08-812 |
| Slayt inkübasyon odası / mikroskop lamı kutusu | Balıkçı | 03-448-5 |
| Brij 35, su içinde 30 w / v% çözelti | Acros Organics | AC32958-0025 |
| Tween-20 | Balıkçı | P337-100 |
| Sodyum periodat (NaIO 4) | Sigma | 311448 |
| L-glutamik asit γ-hidrazit | Sigma | G-7257 |
| Sodyum Asetat Susuz (CH 3 COONa) | Sigma | S2889 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biyolojik Labs | 7500804 |
| Fosfat Tampon Salin (PBS) (10X) | Denville Bilimsel | CP4390-48 |
| Dylight 549 konjuge NeutrAvidin | Thermo | 22837 |
| Proteaz İnhibitör Kokteyl Tabletler | Roche | 4693159001 |
| ChromPure İnsan IgG, Fc parçası | Jackson Immunoresearch | 009-000-008 |
| ChromPure İnsan IgG, tüm molekül | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 |
| ChromPure Fare IgG, tüm molekül | Jackson Immunoresearch | 015-000-003 |
| ChromPure Fare IgG, Fc parçası | Jackson Immunoresearch | 015-000-008 |
| Tavşan ChromPure IgG, tüm molekül | Jackson Immunoresearch | 011-000-003 |
| ChromPure Donkey IgG, tüm molekül | Jackson Immunoresearch | 017-000-003 |
| Mikroarray Tarayıcı | Tecan | LS Reloaded |
Tablo 2. ListesiBu protokolde kullanılan ekipman ve reaktiflerin.
Şema 1 glukanıdır biyomarker bulma işlemi 1 (Adım 2 ila 4) dayalı lektin antikor mikroarray gösteren bir şema: bloker (Glu-hidrazit) ve BSA ile antikor mikroarray engelleyin; 2 (Adım 5):.. Serum örnekleri uygulamak ve yakalamak spesifik antikorların spesifik glikoproteinler; 3 (Adım 6):;: Probe mikroarray görüntüleme için Dylight 549 etiketli NeutrAvidin ile biyotinile AAL. 4 (Adım 7) biyotinile lektin (ler) geçerli
Chemic kullanarak HCC hasta serum örneğinde birden fazla serum glikoproteinleri Örnek Deney 1 glikozilasyon profil Şekil 1. Mikroarray görüntülerimüttefiki birden lektin algılama ile antikor mikroarray engelledi. Iki özdeş mikroarray kaydırak, (A) hiçbir kimyasal olarak bloke veya (B), kimyasal olarak bloke Adım 2'de açıklandığı gibi, her ikisi de, tüm glikozilasyon profil için 2 ile 9 arası adımları, aynı zamanda karşılaştırma amaçlı geçti. (A) ve (B) mikroarray görüntüleri 10 mikron çözünürlükte Adım 8 de taranır. Olmayan kimyasal olarak bloke mikroarray slayt (B)) ilk iki satır görüntüde (D) zoom;; (C) hiçbiri ilk iki satır görüntü yakınlaştırma kimyasal mikroarray slayt (A) bloke (E) Her dizenin içinde antikor düzenlemenin şeması; (F) dizi haritaları: altdizilim içindeki her antikor konumu, her antikor adı 3 noktalar temsil eder; (G) serum örneği ve lektin yeri: Her serum örneği altdizilim bir diyagram gösterileri yapan ve lektin üzerine uygulandı.
Şekil 2. Mikroarray görüntülerisiroz ve HCC hastaları ayrımcılık olduğu biyolojik olarak spesifik serum glikoproteinler üzerine değişmiş fucosylation için numune deney 2 ekran. Örnek Deney 2 bölümünde tarif edildiği gibi mikroarray deneyi yapılmıştır. (A) Aşama 8 den mikroarray sürgünün bütün kayar görüntüsü; her altdizilim içinde antikoru düzenlemenin (B) diyagramıdır; (C) dizi haritalarına: altdizilim içindeki her bir antikor konumu, her bir antikor adı 3 lekeler temsil eder; (D) Bir zoom-serum örneği ile inkübe edildi, bir dizenin görüntü; (E) bir zoom-in PBS kontrolü ile inkübe edilmiş bir dizenin görüntü.
Şekil 3. Örnek deney 1 glukanıdır profil sonuçları. Her çubuk grafik 20 test edilen proteinin birinin lektin bağlanma profili (veya profilleri glukanıdır) temsil eder. Toplam 22 farklı lektinler inci analiz edildiHer protein e glukanıdır profili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Hedef protein ve yakalama antikor seçimi
Antikor mikroarray assay önce belli bir reaktifler ve malzemeler sayılabilir için gerekli ve hazırlanır. Glukanıdır profilleme veya glukanıdır biyomarker tarama, glikoprotein adaylara spesifik antikorların bir panel için bir antikor mikroarray tasarlamak için literatüre veya önceki sonuçlarından göre tespit edilmelidir. Bu antikorlar, genellikle, R & D Systems, vb IgGs gibi farklı satıcılardan satın alınmıştır önceki test bazı IgM ve IgE'nin tamamen kimyasal modifikasyon sonra bunların antijen bağlanma afiniteleri kaybedebilirler olduğunu gösterdi yana yakalama antikorlar tercih edilir.
2. Tasarım ve antikor mikroarray imalatı
Antikor mikroarray imalatı profesyonel ve pahalı microarrayer ve işletimi için iyi eğitilmiş personele ihtiyaç isteğe bağlı bir adımdır. Ancak, özel antikor mikroarray larTure kolayca sağlam bir sonuç için bu Serome Biosciences Inc gibi bir servis sağlayıcıdan yapılabilir, biz bu bizim antikor mikroarray üretiminde kullanılan temassız microarrayer Scienion sciFLEXARRAYER ultra düşük hacimli olarak, temassız bir microarrayer öneririz. Böyle PATH (Gentel Bio A.Ş. WI) veya Slayt H (Shott, PA) gibi yüksek bağlama kapasitesi mikroarray slaytlar.
3. Glikozilasyon profilleme için glukanıdır Bağlayıcı Proteinler (Gbps) seçin ve hazırlayın
Gbps hedef farklı mono veya oligosakkaritler literatürde ve Haab laboratuar 29 tarafından geliştirilen ve Translational Genomics Enstitüsü tutulan bir arama motoru aracılığıyla ulaşabilirsiniz Yüksek spesifite ve afinite ile Gbps seçmek içinhedeflenen glukanıdır epitopları, açılır menüden gelen motifi (epitop) seçin ve "arama." Bu motifi (epitop) için Gbps özel düşük sipariş yüksek kendi logP değerine göre listelenir. Yüksek logP glukanıdır motifi / epitop için güçlü bir bağlanma afinitesi ve özgüllük gösterir. Lektin gelen doğasında spesifik olmayan bağlanma sorunu nedeniyle, bu yöntem hala antikor bazlı analiz gibi optimal değildir. Aynı Varsa Böylece, güçlü bir şekilde, örneğin anti-Lewis x veya anti-sialyl Lewis bir antikor olarak, bir anti-glukanıdır antikorlar kullanılır önermektedir. Tespiti için birden Gbps Kullanımı farklı bağlama profilleri çapraz kontrol etmek ve güvenilir veri bağlama elde etmek için başka bir stratejidir.
4. Veri analizi
Bu yöntem doğal serum proteinlerine algılamak için kullanıldığı için protein-protein kompleksleri yakalanan ve tespit edilebilir. Western Blot veya kütle spektrometresi mikroarray verileri doğrulamak için iyi bir yöntemdir. Bu arada, Aynı mikroarray kullanılarak protein düzeylerinin belirlenmesi Böyle değişikliklerin glikozilasyon seviyesi proteinleri her birinin üzerine artmış olduğu, sadece toplam protein seviyesini değişikliği ya da bağlı olup olmadığı gibi protein glikozilasyon değişikliğin ayrıntıları, bilgi almak için başka bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Hepatit ve Virüs Araştırmaları Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated Concanavalin A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
| Biotinylated Sambucus Nigra Lectin | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
| Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
| Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA |
| Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
| Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
| Biotinylated Wheat Germ Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
| Biotinylated Peanut Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
| Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA |
| Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
| Biotinylated Datura Stramonium Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
| Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
| Biotinylated Soybean Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
| Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
| Biotinylated Vicia Villosa Lectin | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
| Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
| Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
| Biotinylated Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 | JACALIN |
| Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
| Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
| Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
| Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody | GeneTex | GTX62924 | A2M |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | Lee Biosiences | CA1T-80A | A1AT |
| Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | NeoMarkers | RB-367-A1 | ACT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
| Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody | GeneTex | GTX101035 | Transferrin |
| Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody | GeneTex | GTX77130 | Transferrin |
| Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody | Abcam | ab7610 | ApoJ |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
| Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
| Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
| Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody | Assaypro | 60190-05011 | Hemopexin |
| Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
| Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
| Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
| Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
| Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
| Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody | Crystal chem | 8040 | PIVICA |
| Mouse anti-carcin–mbryonic antigen | US biological | C1300 | CEA |
| Mouse anti-CA125 Cancer Antigen | US biological | C0050-01D | CA125 |
| Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen | US biological | C0075-18 | CA19-9 |
| Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
| Biotinylated BSA (positive control) | Home-made | N/A | Bio |
| Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol. | |||
| Non contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
| 384 microplate | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
| Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides | Gentel | PATH | |
| Slide Imprinter (optional) | The Gel Company | WSP60-1 | |
| Shaker | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 000.013 | |
| Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Slide incubation chamber/microscope slide box | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
| Brij 35, 30 w/v% solution in water | Acros Organics | AC32958-0025 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
| Sodium Periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
| L-Glutamic acid γ-hydrazide | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
| Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
| Dylight 549 conjugated NeutrAvidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Group | 4693159001 | |
| ChromPure Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
| ChromPure Donkey IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
| Microarray Scanner | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
| Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol. | |||
References
- Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
- Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
- Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
- Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
- Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
- Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
- Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
- Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
- Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
- Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
- Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
- Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
- Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
- Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
- Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
- Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
- Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
- Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
- Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
- Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
- Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
- Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
- Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
- Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
- Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
- Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
- Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
- Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
- Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
- Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
- Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
