Summary
I denna studie beskriver vi ett förbättrat protokoll för en multiplexerad med hög genomströmning antikropp mikromatris med lektin detektionsmetod som kan användas i glykosylering profilering av specifika proteiner. Detta protokoll innehåller nya tillförlitliga reagenser och avsevärt minskar den tid, kostnad och lab krav på utrustning jämfört med föregående procedur.
Protocol
1. Skriv en antikropp Microarray för analysen
- Späd alla antikroppar till 0,5 mg / ml i fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,2 (PBS).
- Alikvot 40 | il av varje antikropp i den 384-brunnars platta källa.
- Ladda 384-brunnars källa plattan på Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer.
- Ladda 20 bilder PATH microarray på microarrayer som mål.
- Ställ microarrayer att skriva ut 48 identiska subsystem, där 27 antikroppar och proteiner kontroll är fläckig i tre exemplar i ett 9x9 mönster (figur 1E, 1F).
- Starta microarrayer att skriva ut bilderna antikroppar microarray.
- Samla bilderna antikropp microarray, och lagra dem i bilder kassett med torkmedel. Vakuumförsegla kassetten i en plastpåse genom användning vakuumförseglare (Foodsaver).
- Lagra de förseglade microarray objektglasen vid 4 ° C i kylskåp.
2. Kemiskt Blockera Antibody Microarray att förebygga GBPBindning till infångningsantikroppar
Den microarray analysen börjar när microarray bilderna är kemiskt blockerade och varar i cirka 8 timmar. När började microarray analysen måste avslutad (steg 2 till 8).
- Ta mikromatris glider ut ur kylskåpet och jämvikta dem till rumstemperatur under 30 minuter.
- Ta bort den från lagringsboxen och kortfattat skölja dem i fosfatbuffrad saltlösning pH 7,2 med 0,1% Tween 20 (PBST0.1) en gång i en slid tvättställ, och sedan i 15 mM natriumacetatbuffert pH 5,0 med 0,1% Tween (CBT0 0,1) på ett sekventiellt sätt. Inkubera objektglasen i CBT0.1 i 10 minuter i bilden tvätt bassäng.
- Bered en färsk 150 mM NalO 4 i 15 mM natriumacetat pH 5,0 (CB), och hålla i med en bild tvätt bassäng i ett kylskåp och samtidigt undvika ljus innan användning.
- Ta bort bilden från CB och satte den i bassängen med färskt NalO 4 med antikroppen sidanuppåt. Täcka bassängen med aluminiumfolie för att undvika ljus, och inkubera sliden bassängen under 2 timmar med försiktig skakning vid 4 ° C i ett kylskåp.
- Framställ 300 ml 10 mM hydrazid glutaminsyra (blockeraren) i CB.
- Ta bort bild från bassängen, och kort skölj den i CB 3 gånger i 5 minuter varje gång i bild tvätt bassäng.
- Inkubera objektglasen i blockerare i en tvätt bassäng under 2 timmar vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Ta bort bilder från bassängen och tvätta dem med PBST0.1 i 3 minuter.
3. Blockera icke-specifika bindningar till mikromatrisen med bovint serumalbumin (BSA)
- Framställ 300 ml 1% BSA i fosfatbuffrad saltlösning pH 7,2 med 0,5% Tween (PBST0.5) i en slid tvättställ och inkubera i mikroskaran sliden i bassängen under 1 timme vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Skölj glasen i PBST0.1 tre gånger i 3 minuter varje gång.
- Sätt bildenpå en bild rack och centrifugera vid 1200 xg på en centrifugering i 2 minuter för att torka microarray bilden.
4. Imprint Wax Grid på Microarray Slide att separera varje subanordningen
- Förvärmning av vax tryckverket vid 70 ° C under 5 minuter.
- Ladda blockerade microarray glider in vaxet tryckverket med antikropp sidan vänd mot vaxet. Dra försiktigt i handtaget för att avtryck vax på bilden jämnt.
5. Applicera serumprover på Microarray Slide
- Under Steg 2,4, förbereda serumprover för antingen Glyco profilering analys i ett prov (5.1.1), eller enstaka Glyco epiptope mätning mellan flera prover (5.1.2).
- I ett experiment för glykanen profileringar av flera serum glykoproteiner i ett serumprov genom att använda flera GBPs (se exempel experiment 1), kommer en serumprover appliceras på alla subsystemen. I detta fall är 40 | il serum riklig späddes i 360 | il av PBS innehållande 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml mus-IgG, 100 | ig / ml rått-IgG, 100 | ig / ml kanin-IgG, 100 | ig / ml av get-IgG och 100 pg / ml åsna-IgG. Denna volym är tillräcklig för att tillämpa 6 pl utspätt serum lösningen på varje undersystem.
- I ett experiment för en glykan mätning på flera serumproteiner bland flera serumprover med hjälp av en GBP detekteringar (se prov experiment 2). I detta fall är 1 il serum riklig späddes i 9 | il av PBS innehållande 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml mus-IgG, 100 | ig / ml rått-IgG, 100 | ig / ml kanin-IgG , 100 pg / ml av get-IgG och 100 | ig / ml åsna-IgG. Denna volym är tillräcklig för att tillämpa 6 il utspätt serum lösningen på varje undersystem.
- Efter vax avtryck i steg 4, tillämpas försiktigt 6 pl av utspätt prov eller kontrollprover (PBST0.1) till varje undergrupp av bilden. Inkubera bilden i en fuktad kassett med våta pappershanddukar vid rumstemperaturunder 1 timme.
- Skölj sliden med PBST0.1 tre gånger i 3 minuter varje gång.
- Torka bilden genom att snurra den i 1200 xg för 2 minut.
6. Applicera Biotinylerad GBP (Lektin eller Anti-glykan antikropp) på Slide
- Under Steg 2,4, förbereda 10 M-g/ml av biotinylerade lektiner / Gbps i PBST0.1.
- I glykanen profilering experiment som prob ett prov med flera lektiner (prov experiment 1), förbereda 350 pl biotinylerat lektin som är tillräcklig för alla subsystemen.
- I enkel glykan epitop / biomarkör screening i ett flertal prover genom att använda flera lektiner, framställa 10 | il av varje biotinylerade lektinet som är tillräcklig för en subanordningen.
- Applicera 6 pl av det utspädda biotinylerat lektin (er) till varje undergrupp av bilden och inkubera i fuktig bilden lådan med våta pappershanddukar vid rumstemperatur under 1 timme.
- Skölj objektglasen med PBST0.1 tre gånger under 3 minuter vardera timig.
- Torka bilden genom att snurra den på 1200 xg i centrifug för 2 minut.
7. Applicera färgämnesmärkta neutravidin för fluorescensdetektering
- Framställ 350 | il av märkt Dylight 549 neutravidin som är tillräcklig för alla subsystemen.
- Tillämpas 6 | il av märkt Dylight 549 neutravidin på varje undersystem, och inkubera plattan i den fuktsatta sliden kassetten vid rumstemperatur under 1 timme.
- Skölj sliden med PBST0.1 tre gånger i 3 minuter varje gång.
- Torka objektglaset genom att spinna det vid 1200 xg i centrifug för 2 minut.
8. Skaffa Microarray diabilden genom att skanna Slide
- Skanna bilden genom att använda en fluorescens microarray scanner vid 10 m upplösning. Laser och PMT inställningar bör vara så stark som möjligt, men ingen mättnad fläck observeras.
9. Data Extraktion och analys
- Öppna bilden i ArrayPro 3,2. Ställ in arrayen mall enligt matrisen karta som visar antikroppar fläckar platser. Noggrant inrikta varje mall cirkel på motsvarande plats i bilden.
- Utdrag intensiteten för varje punkt i en Excel-fil för vidare analys.
10. Representativa resultat
Prov Experiment 1
Glykosylering profilering av flera serum glykoproteiner i hepatocellulär cancer patienten serumprov genom att använda kemiskt blockerad antikropp microarray med flera lektiner upptäckt.
Målet med detta experiment är att undersöka den individuella glykosyleringsprofil 20 glykoproteiner i hepatocellulär cancer (HCC) patientens serumprov med kemiskt blockerade antikropp microarray med lektin upptäckt. En antikropp microarray, som innehåller 48 identiska subsystem som omfattar 26 antikroppar och biotin-BSA, har konstruerats och tillverkats enligt beskrivningen i STEP 1. Dessa 26 antikroppar var mot 20 serum glykoproteiner som identifierats som lovande tidig diagnos värde för HCC patienter med lektin baserad immunoprecipitation kombineras med masspektrometrisk proteinidentifiering 12, 32 som visas i tabell 1. Mönstret och arrangemanget av antikropp fläckar trycks i triplikat i en representativ undergrupp visas i figur 1e och 1f, respektive. Två identiska microarray bilder, var ett kemiskt blockerad (Figur 1A), medan den andra on (Figur 1B), användes för att utföra samma experiment glykosylering profilering för att visa betydelsen av kemiskt blockera förfarandet för analysen. För det kemiskt blockerade sliden (figur 1B) började försöket vid steg 2, för att inget kemiskt blockerade slid (figur 1 A), började försöket från steg 3. Experimentet utfördes genom following alla steg som beskrivs i protokollet, utom för steg 5.1.2 och 6.1.2. I Steg 5,2 tillsattes en PBST0.1 kontrollprov applicerades på subanordningar i kolonn 1 och 3, och en poolad HCC serumprov sattes på subanordningar i kolumn 2 och 4, respektive (såsom visas i figur 1 g). Denna jämförelse är att visa effektivitet i förfarandet, liksom antigen bindningsaffiniteten av antikroppar efter kemiskt blockering. 22 biotinylerade lektiner (såsom visas i Tabell 1) som är specifik för olika glykaner 18, 20 applicerades på varje undersystem som visas i figur 1 G för glykosylering profilering. Bilder av de kemiskt blockerade (Figur 1B) och icke-kemiskt blockerade (Figur 1A) microarrays efter glykosyleringen profileringen analysen genom att följa protokollet. Som framgår av subsystem i kolumn 1 och 3 i icke-kemiskt blockerade microarrays (Figur 1A och Figur 1C), på vilkaEndast PBST0.1 tillämpades de flesta lektiner bunden att fånga antikroppar och visade mycket hög bakgrund som kan jämföras med de subsystem i kolumn 2 och 4, som serumprovet har tillämpats. Det är omöjligt att få glykanen profilinformation från microarray bild. Tvärtom, när samma experiment utfördes på en kemiskt blockerad antikropp mikromatris sliden, de subsystem i kolonn 1 och 3, på vilken endast PBST0.1 applicerades visade de flesta lektiner inga eller mycket låga bindningar för att fånga antikroppar, medan hög-antigen bindningar observerades fortfarande i subsystemen i kolumn 2 och 4, på vilken serum-prov applicerades (Figur 1B och 1D). Dessa resultat visade kemiskt blockera förfarandet var ett avgörande steg framåt mätning av glykaner på antikroppar fångade-glykoproteiner. Genom att följa protokollet kan glykosylering profiler 22 glykoproteiner i HCC serum erhållas.
Experiment 2
Skärm för förändrade fucosylation på specifika serum glykoproteiner som biomarkörer för diskriminerade levercirros och hepatocellulära patienter karcinomceller.
Målet med detta experiment är att screena för ändrade fukosylering på specifika serum glykoproteiner som biomarkörer som diskriminerar levercirros och hepatocellulär cancer (HCC) patienter. Skiljer sig från den Experiment 1, i vilken endast en serum-prov applicerades på vart subanordningar och sonderades med olika lektiner, i denna analys, totalt 40 olika serumprov från HCC och cirros patienter applicerades på varje undersystem och sonderades med en lektin (AAL ). Statistisk analys, såsom T-test, mottagare i drift Characteristic (ROC) kurva, gjordes för att utvärdera fördelningen eller diagnostisk prestanda hos glykan epiptope / biomarkör för varje individuellt protein i alla serumprover. Vi använde samma antikropp mikromatrisen tillverkas i experiment 1, utom för anti-CA19-9-och anti-Lewis X-antikroppar i denna studie. Den kompeiment genomfördes från 2 september till steg 9 med undantag för steg 5.1.1 och 6.1.1. Totalt 40 serumprover från 20 cirros och 20 patienter HCC applicerades slumpmässigt undergrupp av de 48 subsystem tillsammans med kontrollgrupperna PBS prover som negativ kontroll. Fukosylering av varje fångade proteinerna sedan detekteras med hjälp biotinylerad Fukos-specifik lektin. Mikromatrisen bilden som visas i figur 1 visade lektinet AAL endast bundet till serumproteiner infångade på mikromatrisen (Figur 2D) i stället för infångade antikroppar (Figur 2E). De AAL bindande intensiteten hos alla de punkter extraherades sedan och analyserades med hjälp av T-test och ROC kurvor för att utvärdera prestanda fukosylering (AAL bindande intensitet) för varje serum protein på diskriminering mellan HCC och grupper cirros. Resultaten visade att fukosylering av GP73-protein gav den bästa diskriminering mellan de två grupperna med ett p = 0,03 och ytan under-kurva av ROC-kurvan är lika med 0,72. Detta experiment visade detta förfarande är en snabb, effektiv metod för glykanen epitopen / biomarkör screening på flera prov inom flera proteiner.
| ID | Namnet på reagens | Förkortning | Företaget | Katalog # |
| L1 | Biotinylerad Concanavalin A | ConA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L2 | Biotinylerad Sambucus Nigra Lektin | SNA | Vector Laboratories | B-1305 |
| L3 | Biotinylerad Lens culinaris agglutinin | LCA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L4 | Biotinylerad Ricinus communis agglutinin I | RCA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L5 | Biotinylerad Aleuria Aurantia Lektin | AAL | Vector Laboratories | B-1395 |
| L6 | Biotinylerad Erythrina cristagalli Lektin | ECL- | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L7 | Biotinylerad Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia-lektin II | GSL II | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L8 | Biotinylerad vetegroddsagglutinin | WGA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L9 | Biotinylerad Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | PHA-E | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L10 | Biotinylerad Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | PHA-L | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L11 | Biotinylated jordnötsagglutinin | PNA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L12 | Biotinylerad Pisum sativum agglutinin | PSA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L13 | Biotinylerad Dolichos biflorus agglutinin | DBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L14 | Biotinylerad Datura stramonium Lektin | DSL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L15 | Biotinylerad Sophora Japonica agglutinin | SJA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L16 | Biotinylerad Soybean agglutinin | SBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L17 | Biotinylerad Solanum tuberosum (potatis) Lektin | STL | Vector Laboratories | BK-3000 </ Td> |
| L18 | Biotinylerad Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia-lektin I | GSL I | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L19 | Biotinylerad Vicia villosa Lektin | VVL | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L20 | Biotinylerad Lycopersicon esculentum (tomat) Lektin | LEL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L21 | Biotinylerad Ulex Europaeus agglutinin I | UEA I | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L22 | Biotinylerad jakalin | Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 |
| A1 | Get F (ab ') 2 fragment anti-humant IgM, Fc5μ antikropp | IgM | Jackson Immuno Research | 109-006-129 |
| A2 | Åsna F (ab ') 2Frag-anti-humant IgG (H + L)-antikropp | AB1 | Jackson Immuno Research | 709-006-149 |
| A3 | Mus-anti-human IgG F (ab ') 2-monoklonal antikropp | AB3 | Jackson Immuno Research | 209-005-097 |
| A4 | Get-anti-human alfa 2-makroglobulin polyklonal antikropp | A2M | GeneTex | GTX62924 |
| A5 | Kanin-anti-human alfa-1-antitrypsin-polyklonal antikropp | A1AT | Lee Biosiences | CA1T-80A |
| A6 | Mus-anti-human alfa-1-antitrypsin-monoklonal antikropp | A1AT | Sigma Aldrich | SAB4200198 |
| A7 | Kanin-anti-human alfa-1-antitrypsin-polyklonal antikropp | AGERA | NeoMarkers | RB-367-A1 |
| A8 | Kanin-anti-human alfa-1-antikhymotrypsin polyklonal antikropp | AGERA | Fisher Scientific | RB9213R7 |
| A9 | Mus-anti-humant transferrin monoklonal antikropp | Transferrin | GeneTex | GTX101035 |
| A10 | Kanin-anti-humant transferrin polyklonal antikropp | Transferrin | GeneTex | GTX77130 |
| A11 | Get-anti-human apolipoprotein J polyklonal antikropp | ApoJ | Abcam | ab7610 |
| A12 | Mus-anti-human GP73 monoklonal antikropp | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
| A13 | Mus-anti-human GP73 monoklonal antikropp | GP73 | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-101.275 |
| A14 | Kanin-anti-human alfa-1 fetoprotein polyklonal antikropp | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
| A15 | Mus-anti-human alfa-1 fetoprotein monoklonal antikropp | AFP | Fitzgerald | 10-A05A |
| A16 | Mus-anti-human hemopexin monoklonal antikropp | Hemopexin | Assaypro | 60.190-05.011 |
| A17 | Mus-anti-human glypican-3 (1G12) monoklonal antikropp | GPL3 | Santa Cruz Bio | sc-65.443 |
| A18 | Mus-anti-human kininogen (LMW) monoklonal antikropp | Kininogen | Assaypro | 20.333-05.011 |
| A19 | Kanin-anti-human MMP-21 monoklonal antikropp | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
| A20 | Mus-anti-human CEACAM-1 monoklonal antikropp | CEACAM | R & D Systems | MAB1180 |
| En21 | Råtta anti-human-DPPIV/CD26 monoklonal antikropp | DPPIV | R & D Systems | MAB22441 |
| A22 | Mus-anti-human PIUKA II monoklonal antikropp | PIVICA | Kristall Chem | 8040 |
| A23 | Mus-anti-karcinoembryonalt antigen | CEA | US biologiska | C1300 |
| A24 | Mus-anti-CA125 cancerantigen | CA 125 | US biologiska | C0050-01D |
| A25 | Mus-anti-CA19-9 Cancer antigen | CA19-9 | US biologiska | C0075-18 |
| A26 | Mus-anti-Lewis x-monoklonal antikropp | Lewis X- | Calbiochem | 434.631 |
| bio | Biotinylerat BSA (positiv kontroll) | Bio | Home-made | N / A |
Tabell 1. Förteckning över lektiner och antikroppar som används i detta protokoll.
| Reagensets namn s / utrustning | Företaget | Katalognummer |
| Icke kontakt microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
| 384 mikroplatt | Fisher | 14-230-243 |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
| Ultratunna nitrocellulosa coate mikromatris glider | Gentel | VÄG |
| Skjut tryckverk (tillval) | Den Gel Företaget | WSP60-1 |
| Skakanordning | Fisher | 15-453-211 |
| Centrifugera | Eppendorf | 5804 000.013 |
| Skjut tvätt bassäng / Slide wi färgning Dishte Löstagbar rack | Fisher | 08-812 |
| Slide inkubationskammaren / objektglas box | Fisher | 03-448-5 |
| Brij 35, 30 vikt / volym% lösning i vatten | Acros Organics | AC32958-0025 |
| Tween-20 | Fisher | P337-100 |
| Natriumperiodat (NalO 4) | Sigma | 311.448 |
| L-Glutaminsyra γ-hydrazid | Sigma | G-7257 |
| Natriumacetat Vattenfri (CH3 COONa) | Sigma | S2889 |
| Bovint serumalbumin (BSA) | Lampire Biologisk Labs | 7500804 |
| Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 |
| Dylight 549 konjugerad neutravidin | Thermo | 22.837 |
| Proteasinhibitorcocktail Tabletter | Roche | 4693159001 |
| ChromPure Humant IgG, Fc-fragmentet | Jackson Immunoresearch | 009-000-008 |
| ChromPure Humant IgG, hel molekyl | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 |
| ChromPure mus-IgG, hel molekyl | Jackson Immunoresearch | 015-000-003 |
| ChromPure mus-IgG, Fc-fragmentet | Jackson Immunoresearch | 015-000-008 |
| ChromPure Kanin-IgG, hel molekyl | Jackson Immunoresearch | 011-000-003 |
| ChromPure åsna-IgG, hel molekyl | Jackson Immunoresearch | 017-000-003 |
| Microarray Scanner | Tecan | LS Reloaded |
Tabell 2. Listav utrustning och reagenser som används i detta protokoll.
Schema 1 Ett schema som visar lektin antikroppen microarray baserad glykanen biomarkörer process 1 (steg 2 till 4): Blockera antikroppen microarray med blockerare (Glu-hydrazid) och BSA, 2 (steg 5).. Gäller serumprover och fånga specifika glykoproteiner med specifika antikroppar, 3 (Steg 6): tillämpas biotinylerad lektin (er); 4 (steg 7): Sond den biotinylerade AAL med Dylight märkt 549 neutravidin för mikromatris avbildning.
Figur 1. Microarray bilder av provet Experiment 1 glykosylering profilering av multipla serum glykoproteiner i HCC patientserumprov med hjälp Pharmacallierad blockerad antikropp microarray med flera lektin upptäckt. Två identiska microarray bilder, (A) ingen blockerad kemiskt, eller (b) kemiskt blockerade som beskrivs i steg 2, båda gick igenom alla steg från 2 till 9 för glykosylering profilering samt jämförande syfte. (A) och (B) är microarray bilderna scannas i steg 8 i en resolution av den 10 mikron. (C) zooma in bilden av de två första raderna i någon blockerade kemiskt microarray bild (A), (D) zooma in bilden av de två första raderna i den icke kemiskt blockerade microarray bild (B)), (E) diagrammet av antikroppen arrangemanget inom varje undergrupp, (F) array kartor: placeringen av varje antikropp i subsystemet representerar varje antikropp namn 3 fläckar, (G) Serum provet och lektin plats: Ett diagram visar vilka subanordningen varje serum prov och lektinet appliceras på.
Figur 2. Microarray bilder avurval experiment 2 skärm för ändrade fukosylering på specifika serum glykoproteiner som biomarkörer som diskriminerar levercirros och patienter HCC. Mikromatrisen analysen utfördes såsom beskrivits i Exempel Experiment 2 sektionen. (A) hela diabilden i mikromatrisen sliden från steg 8, (B) i diagrammet av antikroppen arrangemanget inom varje undergrupp; (C) array kartor: placeringen av varje antikropp i den subanordningen, representerar varje antikropp namn 3 fläckar; (D) en zoom-i bilden av en subanordning som inkuberades med serumprov, (e) en zoom-i bilden av en subanordning som inkuberades med PBS-kontroll.
Figur 3. Glykan profilering resultat från provet experiment 1. Varje stapel representerar lektinbindning profil (eller glykan profiler) av en av 20 testade proteinet. Totalt 22 olika lektiner användes för att analysera: ee glykan profil av varje protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Målprotein och infångningsantikropp valet
Före antikroppen microarray analysen, vissa reagenser och material måste beaktas och förberedas. Att designa en antikropp microarray för glykanen profilering eller glykan biomarkör screening, en panel av antikroppar som är specifika för glykoprotein kandidater bör fastställas enligt litteraturen eller från tidigare resultat. Dessa antikroppar var vanligen köptes från olika leverantörer som R & D Systems etc. IgG är att föredra infångningsantikroppar sedan våra tidigare tester visade att en del IgM och IgE helt kan förlora sina antigen bindningsaffiniteter efter kemisk modifiering.
2. Konstruktion och tillverkning av antikroppar microarray
Tillverkning av antikroppen microarray är ett valfritt steg som behöver professionell och dyra microarrayer, och väl utbildad personal för drift. Men anpassade antikropp microarray tillverkningning lätt kan göras från en tjänsteleverantör såsom Serome Biosciences Inc. För en robust resultat rekommenderas en beröringsfri microarrayer, såsom Scienion sciFLEXARRAYER ultralåg volym beröringsfri microarrayer, som användes i vår antikropp mikromatris tillverkning. Hög bindningskapacitet microarray objektglas, såsom PATH (Gentel Bio Inc. WI) eller Sida H (Shott, PA).
3. Välj och Förbered glykan bindande proteiner (Gbps) för glykosylering profilering
GBPs att rikta olika mono-eller oligosackarider kan hittas i litteraturen och genom en sökmotor som utvecklats av Haab laboratoriet 29 och hölls vid den translationella Genomics Institute För att välja GBPs med hög specificitet och affinitet tillriktade glykan epitoperna, välj motiv (epitop) från rullgardinsmenyn och klicka på "Sök". Det GBPs specifikt för detta motiv (epitop) kommer att listas i enlighet med deras logP värde från hög till låg ordning. Högre logP indikerar en starkare bindning affinitet och specificitet till glykanen motivet / epitop. På grund av den inneboende icke-specifik bindning fråga från lektin, är denna metod fortfarande inte så optimal som antikroppen baserad analys. Därför rekommenderar vi starkt att anti-glykan antikroppar används, såsom anti-Lewis x eller anti-sialyl Lewis A-antikroppar, om de finns tillgängliga. Användning av flera GBPs för detektering är en annan strategi för att dubbelkontrollera olika bindande profiler och att få tillförlitliga bindande uppgifter.
4. Dataanalys
Eftersom denna metod används för att detektera nativa serumproteiner, kan protein-protein-komplex kan infångas och detekteras. Western blöt eller masspektrometri är bra metoder för att validera de mikroarraydata. Under tiden, Detektion av proteinnivåer med samma microarray är en annan metod att lära sig detaljerna i glykosylering förändring av proteinet, till exempel om de förändringar berodde på den totala proteinhalten förändring eller bara att glykosylering nivån ökat på varje proteinerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Institutet för hepatit och Virus Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated Concanavalin A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
| Biotinylated Sambucus Nigra Lectin | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
| Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
| Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA |
| Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
| Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
| Biotinylated Wheat Germ Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
| Biotinylated Peanut Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
| Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA |
| Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
| Biotinylated Datura Stramonium Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
| Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
| Biotinylated Soybean Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
| Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
| Biotinylated Vicia Villosa Lectin | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
| Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
| Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
| Biotinylated Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 | JACALIN |
| Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
| Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
| Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
| Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody | GeneTex | GTX62924 | A2M |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | Lee Biosiences | CA1T-80A | A1AT |
| Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | NeoMarkers | RB-367-A1 | ACT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
| Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody | GeneTex | GTX101035 | Transferrin |
| Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody | GeneTex | GTX77130 | Transferrin |
| Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody | Abcam | ab7610 | ApoJ |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
| Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
| Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
| Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody | Assaypro | 60190-05011 | Hemopexin |
| Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
| Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
| Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
| Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
| Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
| Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody | Crystal chem | 8040 | PIVICA |
| Mouse anti-carcin–mbryonic antigen | US biological | C1300 | CEA |
| Mouse anti-CA125 Cancer Antigen | US biological | C0050-01D | CA125 |
| Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen | US biological | C0075-18 | CA19-9 |
| Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
| Biotinylated BSA (positive control) | Home-made | N/A | Bio |
| Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol. | |||
| Non contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
| 384 microplate | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
| Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides | Gentel | PATH | |
| Slide Imprinter (optional) | The Gel Company | WSP60-1 | |
| Shaker | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 000.013 | |
| Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Slide incubation chamber/microscope slide box | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
| Brij 35, 30 w/v% solution in water | Acros Organics | AC32958-0025 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
| Sodium Periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
| L-Glutamic acid γ-hydrazide | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
| Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
| Dylight 549 conjugated NeutrAvidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Group | 4693159001 | |
| ChromPure Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
| ChromPure Donkey IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
| Microarray Scanner | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
| Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol. | |||
References
- Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
- Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
- Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
- Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
- Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
- Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
- Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
- Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
- Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
- Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
- Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
- Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
- Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
- Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
- Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
- Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
- Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
- Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
- Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
- Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
- Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
- Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
- Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
- Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
- Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
- Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
- Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
- Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
- Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
- Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
- Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
