Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

doi: 10.3791/3791 Published: May 4, 2012

Summary

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Test için bir antikor Mikroarray yazdırmak

  1. 0.5 mg / fosfat tampon salin, ph 7.2 (PBS) içinde ml tüm antikorları ile seyreltilir.
  2. 384 kuyucuklu kaynak plakasına alikotu her antikor 40 ul.
  3. Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer üzerine 384-iyi kaynak plaka yükleyin.
  4. Hedef olarak microarrayer üzerine 20 PATH mikroarray slaytlar yükleyin.
  5. 27 antikorları ve kontrol proteinler 9x9 modeli (Şekil 1E, 1F) olarak üç nüsha olarak tespit edildiği 48 özdeş Altdizilim, yazdırmak için microarrayer ayarlayın.
  6. Antikor mikroarray slaytları yazdırmak için microarrayer başlayın.
  7. Antikor mikroarray slaytlar toplayın ve kurutucu ile slaytlar kaset saklayın. Vakum kesme (Foodsaver) kullanarak plastik bir torbaya kaset mühür temizleyin.
  8. 4 ° C'de buzdolabında kapalı mikroarray slaytlar saklayın.

2. Kimyasal GBP Önlemek için Antikor Mikroarray engelleYakalama Antikorlar bağlanarak

Mikroarray testi mikroarray slaytlar kimyasal engellenen bir kez başlar ve yaklaşık 8 saat sürer. Bir kez mikroarray assay tamamlanması için olan açtığı (Basamak 2-8).

  1. Mikroarray buzdolabı kayarak atın ve 30 dakika oda sıcaklığında onları dengeye.
  2. % 0.1 Tween (CBT0 ile 15 mM sodyum asetat tamponu pH 5.0, sonra saklama kutusundan slayt çıkarın ve kısaca havzası yıkama slayt kez% 0.1 Tween 20 (PBST0.1) ile fosfat buffer salin pH 7.2 bunları temizleyin, durulayın ve .1) sıralı bir şekilde. Slayt yıkama havzasında 10 dakika CBT0.1 slaytları inkübe edin.
  3. 15 mM sodyum asetat tamponu pH 5.0 (CB) taze 150 mM NaIO 4 hazırlayın ve kullanılmadan önce hafif kaçınarak buzdolabında lavabo çamaşır slayt halinde saklayın.
  4. CB slayt çıkarın ve antikor yan taze NaIO 4 içeren havza içine koyduyukarı bakacak. Işık önlemek ve nazik bir buzdolabında 4 ° C'de çalkalanarak 2 saat slayt havza inkübe için alüminyum folyo ile havza örtün.
  5. CB'de 10 mM hidrazit glutamik asit (engelleyici), 300 mL hazırlayın.
  6. Havzasından slayt çıkarın ve kısaca 3 kez 5 dakika slayt yıkama havzasında her zaman için CB durulayınız.
  7. Nazik bir çalkalama ile oda sıcaklığında 2 saat için bir çamaşır havzasında bloker slaytları inkübe.
  8. Havzasından slaytlar çıkarın ve 3 dakika PBST0.1 ile yıkayın.

3. Bovine Serum Albumin ile Mikroarray özgü olmayan Bağlar engelleme (BSA)

  1. Slayt çamaşır havzasında% 0.5 Tween (PBST0.5) ile fosfat tampon tuzlu pH 7,2% 1 BSA 300 ml hazırlayın ve hafifçe sallayarak oda sıcaklığında 1 saat havzasında mikroarray slayt inkübe.
  2. 3 dakika için her seferinde üç kez PBST0.1 slaytları çalkalayın.
  3. Slayt koyunmikroarray slayt kuruması için 2 dakika santrifüj üzerine 1200 xg'de bir slayt raf ve dönüşlerde.

4. Her altdizilim ayırın için Mikroarray Slayt üzerine Künye Wax Izgara

  1. 70 de balmumu imprinter ön-ısıtma 5 dakika boyunca ° C.
  2. Balmumu bakan antikor yüzü balmumu imprinter içine bloke mikroarray slayt yükleyin. Yavaşça eşit slayt üzerine künye balmumu kolu çekin.

5.. Mikroarray Slayt üzerine Serum Örnekleri Uygula

  1. Adım 2.4 sırasında birden fazla numune (5.1.2) arasında bir örnekte gliko profilleme assay (5.1.1), veya tek gliko epiptope ölçümü ya da serum numuneleri hazırlamak.
    1. Birden fazla Gbps (Örnek Deney 1 bakınız) kullanılarak bir serum numunesi içinde birden çok serum glikoproteinleri glukanıdır profilings için bir deneyde, bir serum numuneleri, tüm Altdizilim üzerine tatbik edilir. Bu durumda, 40 ul serumu içeren geniş bir 0.1% 360 ul PBS içinde seyreltilirTween-20,% 0.1 Brij 35, 100 ug / fare IgG, 100 ug / sıçan IgG mL, 100 ug / tavşan IgG, 100 ug / mL keçi IgG ve 100 ug / ml eşek IgG mL mL. Bu birim her altdizilim üzerine sulandırılmış serum solüsyonu 6 ul uygulanması için yeterlidir.
    2. Bir GBP tespitlerde (örnek deney 2) kullanarak birden serum örnekleri arasında birden fazla serum protein bir glukanıdır ölçümü için bir deneyde. Bu durumda, 1 ul PBS serum yeterli içeren% 0.1 arasında 9 ul içinde seyreltilir Tween-20,% 0.1 Brij 35, fare IgG, 100 ug / sıçan IgG mL, 100 ug / tavşan IgG mL 100 ug / ml , 100 ug / keçi IgG ve 100 ug / eşek IgG mL mL. Bu birim her altdizilim üzerine sulandırılmış serum solüsyonu 6 uL uygulanması için yeterlidir.
  2. Adım 4 balmumu atama, dikkatli bir slayt her altdizilim seyreltilmiş numuneye veya kontrol örneklerinin 6 uL (PBST0.1) uyguladıktan sonra. Oda sıcaklığında ıslak kağıt havlu ile nemlendirilmiş bir kaset slayt inkübe1 saat karıştırıldı.
  3. 3 dakika için her seferinde üç kez PBST0.1 ile kayar çalkalayın.
  4. 2 dakika için 1200 xg'de dönerken tarafından slayt kurulayın.

6. Slayt üzerine tinile YTL (lektin veya Anti-glikan Antikor) uygulayın

  1. Adım 2.4 sırasında, PBST0.1 yılında biyotinile lektinler / Gbps 10μg/ml hazırlamak.
    1. Glukanıdır profilleme deneyde birden lektinler ile prob bir örnek (numune deney 1), tüm Altdizilim için yeterlidir biyotinile lektin 350 uL hazırlamak olduğunu.
    2. Birden lektinler kullanarak birden çok örneklerinde tek glukanıdır epitop / biyomarker tarama, bir altdizilim için yeterli olduğunu, her biyotinile lektin 10 ul hazırlamak.
  2. Sürgünün her altdizilim ile seyreltilmiş biyotinile lektin (ler) in 6 uL uygulamak ve 1 saat için oda sıcaklığında ıslak kağıt havlu ile nemlendirilmiş kayar kutusuna inkübe edilir.
  3. 3 dakika her ti için PBST0.1 üç kez slaytlar durulayınbana.
  4. 2 dakika santrifüj 1200 xg'de dönerken tarafından slayt kurulayın.

7. Floresan Algılama için Boya Etiketli NeutrAvidin Uygula

  1. Tüm Altdizilim için yeterlidir Dylight 549 etiketli NeutrAvidin 350 uL hazırlayın.
  2. Her altdizilim üzerine Dylight 549 etiketli NeutrAvidin 6 uL uygulamak ve 1 saat için oda sıcaklığında nemlendirilmiş kayar kaset kayar inkübe edilir.
  3. 3 dakika için her seferinde üç kez PBST0.1 ile kayar çalkalayın.
  4. 2 dakika santrifüj 1200 xg'de dönerken tarafından slayt kurulayın.

8. Slayt Tarama tarafından Mikroarray Slayt Resim edinin

  1. 10 mikron çözünürlükte bir floresan mikroarray tarayıcı kullanarak slayt tarayın. Lazer ve PMT ayarları mümkün olduğu kadar kuvvetli olması gerekir, ancak hiçbir yerinde doygunluk görülmektedir.

9. Veri çıkarımı ve Analiz

  1. ArrayPro 3.2 resim açın. Antikor noktalar konumları gösteriyor dizi haritaya göre dizi şablon ayarlama. Dikkatlice görüntüsünde karşılık gelen nokta üzerine her şablon daire hizalayın.
  2. Daha fazla analiz için bir Excel dosyası içine her yerinde şiddeti ayıklayın.

10. Temsilcisi Sonuçlar

Örnek Deney 1

Birden fazla lektinler algılama ile kimyasal bloke antikor mikroarray kullanarak hepatosellüler karsinom hasta serum örneğinde birden fazla serum glikoproteinleri glikozilasyonu profilleme.

Bu denemenin amacı, lektin algılama ile kimyasal olarak bloke antikor mikroarray ile hepatoselüler karsinom (HCC) hasta serum örneğinde 20 glikoproteinler bireysel glikozilasyon profilini ortaya koymaktır. S açıklandığı gibi 26 antikor ve biyotin-BSA dahil 48 özdeş Altdizilim içeren bir antikor mikroarray, tasarlanmış ve imal edildi1 Tep. Bunlar, 26 antikorları Tablo 1 'de gösterildiği gibi kütle spektrometrik proteini tanımlama 12, 32 ile birleştirilmiş lektin bazlı immünopresipitasyon kullanılarak HCC hastalar için erken teşhis değeri sözü olarak tanımlanan 20 serum glikoproteinleri karşı edildi. Bir temsilci alt dizisinde üç nüsha basılmış antikor lekelerin desen ve düzenleme sırasıyla Şekil 1E ve 1F gösterilmiştir. Diğer bir (Şekil 1B), analiz için kimyasal olarak bloke prosedürü önemini göstermek için aynı glikozilasyon profil deneyi yürütmek için kullanılan iken iki özdeş mikroarray kaydırak, bir kimyasal olarak, (Şekil 1A) bloke değildi. Kimyasal olarak bloke slayt (Şekil 1B) için, deneme Adım 2 başlayan; hiçbiri kimyasal bloke slayt (Şekil 1A) için, deney Adım 3 başladı. Deney followin tarafından gerçekleştirilmiştirg Adım 5.1.2 ve 6.1.2 dışında protokolü açıklanan tüm adımları. Basamak 5.2 'de, bir PBST0.1 kontrol örneği kolon 1 ve 3'te Altdizilim üzerine tatbik edildi ve bir havuza HCC serum numunesi (Şekil 1 G gösterildiği) sütunu 2 ve 4, sırasıyla, in Altdizilim üzerine uygulandı. Bu karşılaştırma kimyasal olarak engelleme etkinliği sonra, işlem verimi yanı sıra antikor antijen bağlanma afiniteleri göstermektir. Glikozilasyon profil için Şekil 1 G 'de gösterildiği gibi, farklı glukanlardır 18, 20 özgü her altdizilim üzerine tatbik edildi olduğu 22 biyotinile lektinler (Tablo 1 içinde gösterildiği gibi). Protokolü izleyerek glikozilasyon profil testi sonra kimyasal olarak bloke (Şekil 1B) ve non-kimyasal olarak bloke (Şekil 1A) microarrays Görüntüler. Gibi non-kimyasal olarak bloke mikroarray'ler (Şekil 1A ve Şekil 1C), sütun 1 ve 3'te gösterilen Altdizilim hangiSadece PBST0.1 en lektinler antikorlar yakalamak için bağlı, uygulanır ve serum numunesi başvurusu yapılan sütun 2 ve 4, olanlar Altdizilim bu karşılaştırılabilir çok yüksek arka gösterdi. Bu mikroarray slayttan glukanıdır profil bilgileri elde etmek mümkün değildir. Tam tersine, aynı deney, bir kimyasal olarak bloke antikoru mikroarray kayar üzerinde yapıldı olduğunda, kolon 1 ve sadece PBST0.1 uygulanmıştır hangi 3, in Altdizilim, en lektinler antikorlar yakalamak için hiç ya da çok düşük bağları gösterdi; süre yüksek antijen bağları hala serum örneği (Şekil 1B ve 1D) uygulanan yapıldığı, sütun 2 ve 4 Altdizilim gözlendi. Bu sonuç, kimyasal olarak bloke prosedürü antikoru-tutsak glikoproteinleri üzerine glukanlardır ölçümü öne kritik bir adım olduğunu gösterdi. Protokolü takip edilerek, HCC serum 22 glikoproteinlerinin glikozilasyon profilleri elde edilebilir.

Deney 2

Değişmiş fucos için ekranayrımcılık siroz ve karaciğer kanseri hastalara biyolojik olarak spesifik serum glikoproteinler üzerine ylation.

Bu denemenin amacı, karaciğer sirozu ve hepatoselüler karsinom (HCC) hasta ayrımcılık biyolojik olarak spesifik serum glikoproteinler üzerine değişmiş fucosylation için ekran etmektir. Bu testte sadece bir serum örneği her Altdizilim üzerine uygulanır ve çeşitli lektinler ile probed edildiği Deney 1,,, HCC ve siroz hastalarının toplam 40 farklı serum örneklerinde farklı her altdizilim üzerine uygulanır ve bir lektin (AAL ile probed edildi ). Böyle T testi, alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi gibi istatistiksel analiz, dağılımları veya tüm serum örneklerinde her protein glukanıdır epiptope / biyomarker tanısal performansını değerlendirmek amacıyla yapıldı. Bu çalışmada, anti-CA19-9 ve anti-Lewis X antikorları dışında Deney 1 imal aynı antikoru mikroarray kullanılır. Experiment Adım 5.1.1 ve 6.1.1 dışında Adım 9 Eylül 2 den gerçekleştirildi. Toplam 20 siroz 40 serum numuneleri ve 20 HCC hastaları negatif kontrol olarak kontrol PBS örnekleri ile birlikte 48 Altdizilim rastgele altdizilim de uygulanmıştır. Her yakalanan proteinlerin Fucosylation sonra biyotinile fucose spesifik lektin kullanılarak tespit edildi. Şekil 1 de gösterildiği mikroarray görüntü yerine yalnızca yakalanan antikorların mikroarray (Şekil 2B) (Şekil 2E) üzerinde yakalandı serum proteinlerine lektin AAL göstermiştir. Tüm lekelerin AAL bağlayıcı şiddetleri sonra ayıklanır ve HCC ve siroz gruplar arasında ayrımcılık her serum protein fucosylation (AAL bağlayıcı yoğunluğu) performansını değerlendirmek için T testi ve ROC eğrileri kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar GP73 protein fucosylation bir p = 0.03 iki grup ayrımını en iyi veren ve alan-under-gösterdiROC eğrisi eğrisi 0.72 eşittir. Bu deney, bu prosedür çoklu proteinlerden içinde birden çok örnekleri üzerinde glukanıdır epitop / biyomarker tarama için hızlı, etkili bir yöntemdir gösterdi.

Kimlik Reaktif Adı Kısaltma Şirket # Kataloğa
L1 Biyotinile Concanavalin A ConA Vektör Laboratuvarları BK-1000
L2 Tinile Sambucus Nigra Lektin SNA Vektör Laboratuvarları B-1305
L3 Tinile Lens Culinaris Aglütinin LCA Vektör Laboratuvarları BK-2000
L4 Ricinus Communis Aglütinin Ben biyotinile RCA Vektör Laboratuvarları BK-1000
L5 Tinile Aleuria Aurantia Lektin AAL Vektör Laboratuvarları B-1395
L6 Tinile Erythrina Cristagalli Lektin ECL Vektör Laboratuvarları BK-3000
L7 Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin II GSL II Vektör Laboratuvarları BK-3000
L8 Tinile buğday tohumu Aglütinin WGA Vektör Laboratuvarları BK-1000
L9 Tinile Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin PHA-E Vektör Laboratuvarları BK-2000
L10 Tinile Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin PHA-L Vektör Laboratuvarları BK-2000
L11 Biotinylated Fıstık Aglütinin PNA Vektör Laboratuvarları BK-1000
L12 Pisum Sativum Aglütinin biyotinile PSA Vektör Laboratuvarları BK-2000
L13 Tinile Dolichos tohumları biflorus Aglütinin DBA Vektör Laboratuvarları BK-1000
L14 Tinile Datura stramonium Lektin DSL Vektör Laboratuvarları BK-3000
L15 Tinile Sophora Japonica Aglütinin SJA Vektör Laboratuvarları BK-2000
L16 Tinile Soya Aglütinin SBA Vektör Laboratuvarları BK-1000
L17 Tinile Solanum Tuberosum (Patates) Lektin STL Vektör Laboratuvarları BK-3000 </ Td>
L18 Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin I GSL I Vektör Laboratuvarları BK-2000
L19 Tinile Vicia villosa Lektin VVL Vektör Laboratuvarları BK-2000
L20 Tinile Lycopersicon esculentum (Domates) Lektin LEL Vektör Laboratuvarları BK-3000
L21 Tinile Ulex europaeus Aglütinin I UEA I Vektör Laboratuvarları BK-1000
L22 Biyotinile Jacalin JACALIN Vektör Laboratuvarları BK-3000
A1 Keçi F (ab ') 2 Fragment anti-insan IgG, Fc5μ antikoru IgM Jackson Immuno Araştırma 109-006-129
A2 Eşek F (ab ') 2Frag anti-insan IgG (H + L) antikoru AB1 Jackson Immuno Araştırma 709-006-149
A3 Fare anti-insan IgG F (ab ') 2 monoklonal antikor AB3 Jackson Immuno Araştırma 209-005-097
A4 Keçi anti-insan alfa 2 makroglobulin poliklonal antikor A2M GeneTex GTX62924
A5 Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 Fare anti-insan alfa-1-antitripsin monoklonal antikor A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor ACT Boyandı RB-367-A1
A8 Tavşan anti-insan alfa-1-antikhymotrypsin poliklonal antikor ACT Fisher Scientific RB9213R7
A9 Fare anti-insan transferin monoklonal antikor Transferrin GeneTex GTX101035
A10 Tavşan anti-insan transferin poliklonal antikor Transferrin GeneTex GTX77130
A11 Keçi anti-insan apolipoprotein J poliklonal antikor APOJ Abcam ab7610
A12 Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor GP73 Abbott 14H4-23
A13 Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor GP73 SANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİ A.Ş. sc-101.275
A14 Tavşan anti-insan alfa-1 fetoprotein poliklonal antikor AFP GenWay GWB-41C966
A15 Fare anti-insan alfa-1 fetoprotein monoklonal antikor AFP Fitzgerald 10-A05A
A16 Fare anti-insan hemopexin monoklonal antikor Hemopexin Assaypro 60190-05011
A17 Fare anti-insan glypican-3 (1G12) monoklonal antikor GPL3 Santa Cruz Bio sc-65.443
A18 Fare anti-insan Kininogen (LMW) monoklonal antikor Kininogen Assaypro 20333-05011
A19 Tavşan anti-insan MMP-21 monoklonal antikor MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Fare anti-insan CEACAM-1 monoklonal antikor CEACAM R & D Systems MAB1180
A21 Sıçan anti-insan DPPIV/CD26 monoklonal antikor DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Fare anti-insan PIVKA II monoklonal antikor PIVICA Kristal chem 8040
A23 Fare anti-karsinoembriyonik antijen CEA ABD biyolojik C1300
A24 Fare anti-CA125 Kanser Antijen CA125 ABD biyolojik C0050-01D
A25 Fare anti-CA19-9 Cancer antijeni CA19-9 ABD biyolojik C0075-18
A26 Fare anti-Lewis x monoklonal antikor Lewis X Calbiochem 434631
bio Tinile BSA (pozitif kontrol) Bio Ev yapımı N / A

Bu protokolde kullanılan lektinler ve antikorların Tablo 1. Listesi.

Reaktif s / ekipmanları Adı Şirket Katalog numarası
Temassız microarrayer BioDot A.Ş. sciFLEXARRAYER
384 mikroplaka Balıkçı 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitroselüloz coate mikroarray slaytlar Gentel PATH
Slayt Damgalayıcı (isteğe bağlı) Jel Şirket WSP60-1
Shaker Balıkçı 15-453-211
Santrifüj Eppendorf 5804 000.013
Havza / Slayt Boyama Bulaşık yıkama wi kaydırınth Çıkarılabilir Raf Balıkçı 08-812
Slayt inkübasyon odası / mikroskop lamı kutusu Balıkçı 03-448-5
Brij 35, su içinde 30 w / v% çözelti Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Balıkçı P337-100
Sodyum periodat (NaIO 4) Sigma 311448
L-glutamik asit γ-hidrazit Sigma G-7257
Sodyum Asetat Susuz (CH 3 COONa) Sigma S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biyolojik Labs 7500804
Fosfat Tampon Salin (PBS) (10X) Denville Bilimsel CP4390-48
Dylight 549 konjuge NeutrAvidin Thermo 22837
Proteaz İnhibitör Kokteyl Tabletler Roche 4693159001
ChromPure İnsan IgG, Fc parçası Jackson Immunoresearch 009-000-008
ChromPure İnsan IgG, tüm molekül Jackson Immunoresearch 009-000-003
ChromPure Fare IgG, tüm molekül Jackson Immunoresearch 015-000-003
ChromPure Fare IgG, Fc parçası Jackson Immunoresearch 015-000-008
Tavşan ChromPure IgG, tüm molekül Jackson Immunoresearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, tüm molekül Jackson Immunoresearch 017-000-003
Mikroarray Tarayıcı Tecan LS Reloaded

Tablo 2. ListesiBu protokolde kullanılan ekipman ve reaktiflerin.

Şema 1
Şema 1 glukanıdır biyomarker bulma işlemi 1 (Adım 2 ila 4) dayalı lektin antikor mikroarray gösteren bir şema: bloker (Glu-hidrazit) ve BSA ile antikor mikroarray engelleyin; 2 (Adım 5):.. Serum örnekleri uygulamak ve yakalamak spesifik antikorların spesifik glikoproteinler; 3 (Adım 6):;: Probe mikroarray görüntüleme için Dylight 549 etiketli NeutrAvidin ile biyotinile AAL. 4 (Adım 7) biyotinile lektin (ler) geçerli

Şekil 1
Chemic kullanarak HCC hasta serum örneğinde birden fazla serum glikoproteinleri Örnek Deney 1 glikozilasyon profil Şekil 1. Mikroarray görüntülerimüttefiki birden lektin algılama ile antikor mikroarray engelledi. Iki özdeş mikroarray kaydırak, (A) hiçbir kimyasal olarak bloke veya (B), kimyasal olarak bloke Adım 2'de açıklandığı gibi, her ikisi de, tüm glikozilasyon profil için 2 ile 9 arası adımları, aynı zamanda karşılaştırma amaçlı geçti. (A) ve (B) mikroarray görüntüleri 10 mikron çözünürlükte Adım 8 de taranır. Olmayan kimyasal olarak bloke mikroarray slayt (B)) ilk iki satır görüntüde (D) zoom;; (C) hiçbiri ilk iki satır görüntü yakınlaştırma kimyasal mikroarray slayt (A) bloke (E) Her dizenin içinde antikor düzenlemenin şeması; (F) dizi haritaları: altdizilim içindeki her antikor konumu, her antikor adı 3 noktalar temsil eder; (G) serum örneği ve lektin yeri: Her serum örneği altdizilim bir diyagram gösterileri yapan ve lektin üzerine uygulandı.

Şekil 2
Şekil 2. Mikroarray görüntülerisiroz ve HCC hastaları ayrımcılık olduğu biyolojik olarak spesifik serum glikoproteinler üzerine değişmiş fucosylation için numune deney 2 ekran. Örnek Deney 2 bölümünde tarif edildiği gibi mikroarray deneyi yapılmıştır. (A) Aşama 8 den mikroarray sürgünün bütün kayar görüntüsü; her altdizilim içinde antikoru düzenlemenin (B) diyagramıdır; (C) dizi haritalarına: altdizilim içindeki her bir antikor konumu, her bir antikor adı 3 lekeler temsil eder; (D) Bir zoom-serum örneği ile inkübe edildi, bir dizenin görüntü; (E) bir zoom-in PBS kontrolü ile inkübe edilmiş bir dizenin görüntü.

Şekil 3
Şekil 3. Örnek deney 1 glukanıdır profil sonuçları. Her çubuk grafik 20 test edilen proteinin birinin lektin bağlanma profili (veya profilleri glukanıdır) temsil eder. Toplam 22 farklı lektinler inci analiz edildiHer protein e glukanıdır profili.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Hedef protein ve yakalama antikor seçimi

Antikor mikroarray assay önce belli bir reaktifler ve malzemeler sayılabilir için gerekli ve hazırlanır. Glukanıdır profilleme veya glukanıdır biyomarker tarama, glikoprotein adaylara spesifik antikorların bir panel için bir antikor mikroarray tasarlamak için literatüre veya önceki sonuçlarından göre tespit edilmelidir. Bu antikorlar, genellikle, R & D Systems, vb IgGs gibi farklı satıcılardan satın alınmıştır önceki test bazı IgM ve IgE'nin tamamen kimyasal modifikasyon sonra bunların antijen bağlanma afiniteleri kaybedebilirler olduğunu gösterdi yana yakalama antikorlar tercih edilir.

2. Tasarım ve antikor mikroarray imalatı

Antikor mikroarray imalatı profesyonel ve pahalı microarrayer ve işletimi için iyi eğitilmiş personele ihtiyaç isteğe bağlı bir adımdır. Ancak, özel antikor mikroarray larTure kolayca sağlam bir sonuç için bu Serome Biosciences Inc gibi bir servis sağlayıcıdan yapılabilir, biz bu bizim antikor mikroarray üretiminde kullanılan temassız microarrayer Scienion sciFLEXARRAYER ultra düşük hacimli olarak, temassız bir microarrayer öneririz. Böyle PATH (Gentel Bio A.Ş. WI) veya Slayt H (Shott, PA) gibi yüksek bağlama kapasitesi mikroarray slaytlar.

3. Glikozilasyon profilleme için glukanıdır Bağlayıcı Proteinler (Gbps) seçin ve hazırlayın

Gbps hedef farklı mono veya oligosakkaritler literatürde ve Haab laboratuar 29 tarafından geliştirilen ve Translational Genomics Enstitüsü tutulan bir arama motoru aracılığıyla ulaşabilirsiniz Yüksek spesifite ve afinite ile Gbps seçmek içinhedeflenen glukanıdır epitopları, açılır menüden gelen motifi (epitop) seçin ve "arama." Bu motifi (epitop) için Gbps özel düşük sipariş yüksek kendi logP değerine göre listelenir. Yüksek logP glukanıdır motifi / epitop için güçlü bir bağlanma afinitesi ve özgüllük gösterir. Lektin gelen doğasında spesifik olmayan bağlanma sorunu nedeniyle, bu yöntem hala antikor bazlı analiz gibi optimal değildir. Aynı Varsa Böylece, güçlü bir şekilde, örneğin anti-Lewis x veya anti-sialyl Lewis bir antikor olarak, bir anti-glukanıdır antikorlar kullanılır önermektedir. Tespiti için birden Gbps Kullanımı farklı bağlama profilleri çapraz kontrol etmek ve güvenilir veri bağlama elde etmek için başka bir stratejidir.

4. Veri analizi

Bu yöntem doğal serum proteinlerine algılamak için kullanıldığı için protein-protein kompleksleri yakalanan ve tespit edilebilir. Western Blot veya kütle spektrometresi mikroarray verileri doğrulamak için iyi bir yöntemdir. Bu arada, Aynı mikroarray kullanılarak protein düzeylerinin belirlenmesi Böyle değişikliklerin glikozilasyon seviyesi proteinleri her birinin üzerine artmış olduğu, sadece toplam protein seviyesini değişikliği ya da bağlı olup olmadığı gibi protein glikozilasyon değişikliğin ayrıntıları, bilgi almak için başka bir yöntemdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Hepatit ve Virüs Araştırmaları Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter