Summary
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.
Protocol
1. הדפס microarray נוגדן עבור assay
- לדלל את כל הנוגדנים ל 0.5 מ"ג / מ"ל של תמיסת מלח פוספט חיץ, pH 7.2 (PBS).
- Aliquot 40 μl של נוגדן זה לתוך צלחת 384, גם המקור.
- טען את צלחת 384 גם מקור על microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
- טען 20 microarray שקופיות נתיב אל microarrayer כמטרה.
- הגדר את microarrayer להדפיס 48 subarrays זהים, בהם 27 נוגדנים וחלבונים שליטה הם הבחינו בשלושה עותקים בדפוס 9x9 (איור 1E, 1F).
- התחל microarrayer להדפיס את microarray שקופיות נוגדנים.
- לאסוף את microarray שקופיות נוגדנים, ולאחסן אותם קלטת שקופיות עם יבוש. אבק לאטום את הקלטת בתוך שקית ניילון באמצעות ואקום אוטם (Foodsaver).
- אחסן את השקופיות microarray חתום על 4 מעלות במקרר.
2. מבחינה כימית חסום microarray נוגדן למניעת GBPקשירה של נוגדנים ללכוד
Assay microarray מתחיל פעם אחת את השקופיות microarray חסומים כימית נמשך כ -8 שעות. פעם אחת התחיל assay microarray יש להסתיים (שלבים 2 עד 8).
- קח microarray מחליק מהמקרר, ואת לאזן אותם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- להסיר את השקופית מתיבת אחסון בקצרה לשטוף אותם פוספט pH 7.2 חיץ מלוחים עם 0.1% Tween 20 (PBST0.1) פעם שקופית כביסה אגן ולאחר מכן, 15 mM pH נתרן אצטט חיץ 5.0 עם 0.1% Tween (CBT0 0.1) באופן רציף. דגירה את השקופיות ב CBT0.1 במשך 10 דקות באגן שקופיות כביסה.
- הכן mM טרי 150 NaIO 4 ב 15 נתרן אצטט mM מאגר ה-pH 5.0 (CB), ולשמור אותו לתוך השקופית כביסה אגן במקרר תוך הימנעות אור לפני השימוש.
- להסיר את השקופית מ CB, והכניס אותו לתוך הכיור ובו NaIO טרי 4 עם הצד נוגדןפונה כלפי מעלה. מכסים את הקערה בנייר כסף, כדי למנוע אור, דגירה אגן שקופיות למשך 2 שעות עם עדין רועדת על 4 מעלות במקרר.
- הכינו 300 מ"ל של 10 חומצה גלוטמית hydrazide mM (חוסם) ב CB.
- להסיר את השקופית מן האגן, בקצרה לשטוף אותו CB 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם באגן שקופיות כביסה.
- דגירה של שקופיות חוסם באגן כביסה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
- הסר את השקופיות מן האגן, ולשטוף אותם עם PBST0.1 במשך 3 דקות.
3. חסום שאינם ספציפיים Bindings ל microarray עם אלבומין בסרום שור (BSA)
- הכינו 300 מ"ל של BSA 1% פוספט pH 7.2 חיץ מלוחים עם Tween 0.5% (PBST0.5) באגן שקופית כביסה, ו דגירה שקופיות microarray באגן שעה 1 בטמפרטורת החדר עם בעדינות רועד.
- יש לשטוף את השקופיות ב PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
- לשים את השקופיתעל מדף השקופית ולאחר ספין XG ב 1200 על צנטריפוגה 2 דקות כדי לייבש את השקופית microarray.
4. חותם השעווה רשת לשקופית microarray להפריד כל Subarray
- טרום חימום imprinter שעווה על 70 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- טען את השקופית microarray חסמו את imprinter שעווה עם הצד הפונה אל הנוגדן שעווה. משוך בעדינות את הידית חותם שעווה לשקופית באופן שווה.
5. החל דגימות סרום לשקופית microarray
- במהלך שלב 2.4, להכין דגימות סרום assay או פרופיל glyco במדגם 1 (5.1.1), או מדידה אחת glyco epiptope בין דוגמאות רבות (5.1.2).
- בניסוי על profilings glycan של גליקופרוטאינים בסרום מספר במדגם 1 בסרום באמצעות מספר רב של Gbps (ראה הניסוי מדגם 1), אחד דגימות סרום יחולו על כל subarrays. במקרה זה, 40 מספיק סרום μl הוא מדולל לתוך μl 360 של PBS המכיל 0.1%Tween-20, 0.1% Brij 35, 100 מיקרוגרם / מ"ל של העכבר IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל של עכברוש IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל של ארנב IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל של עז IgG ו - 100 מיקרוגרם / מ"ל של החמור IgG. נפח זה מספיק ליישום 6 μl של פתרון בסרום בדילול מלא על כל subarray.
- בניסוי למדידת glycan 1 על חלבונים בסרום מרובים בין דגימות סרום מרובים באמצעות אחת לתגליות GBP (ראה הניסוי מדגם 2). במקרה זה, 1 מספיק סרום μl הוא מדולל לתוך μl 9 של PBS המכיל 0.1% Tween-20, 0.1% Brij 35, 100 מיקרוגרם / מ"ל של העכבר IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל של עכברוש IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל של ארנב IgG , 100 מיקרוגרם / מ"ל של עז IgG ו - 100 מיקרוגרם / מ"ל של החמור IgG. נפח זה מספיק ליישום 6 μL של פתרון בסרום בדילול מלא על כל subarray.
- לאחר חותם שעווה בשלב 4, בזהירות להחיל 6 μL מדגם בדילול מלא או דגימות בקרה (PBST0.1) כדי subarray כל השקופית. דגירה שקופית קלטת humidified במגבות נייר רטובות בטמפרטורת החדרשעה 1.
- יש לשטוף את השקופית עם PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
- לייבש את השקופית על ידי ספינינג אותו XG 1200 דקה 2.
6. החל GBP Biotinylated (נוגדן Lectin או נגד glycan) לשקופית
- במהלך שלב 2.4, להכין 10μg/ml של לקטינים biotinylated / Gbps ב PBST0.1.
- בניסוי פרופיל glycan כי בדיקה דגימה אחת עם לקטינים רבים (דוגמת ניסוי 1), להכין 350 μL של lectin biotinylated כי היא מספקת את כל subarrays.
- ההקרנה אחת epitope / סמן glycan בדגימות מרובים באמצעות לקטינים רבים, להכין 10 μl של lectin כל biotinylated זה מספיק subarray 1.
- החל 6 μL של lectin biotinylated בדילול מלא (ים) subarray כל שקופית, ולאחר דגירה בתיבה שקופיות humidified במגבות נייר רטובות בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
- יש לשטוף את השקופיות עם PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות כל טילי.
- לייבש את השקופית על ידי ספינינג אותו XG 1200 בצנטריפוגה במשך דקה 2.
7. החל NeutrAvidin תווית דיי גילוי Fluorescence
- הכן 350 μL של NeutrAvidin 549 Dylight שכותרתו כי היא מספקת את כל subarrays.
- החל 6 μL של NeutrAvidin 549 Dylight שכותרתו subarray על כל אחד, דגירה שקופית קלטת שקופיות humidified בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
- יש לשטוף את השקופית עם PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
- לייבש את השקופית על ידי ספינינג אותו XG 1200 בצנטריפוגה במשך דקה 2.
8. להשיג תמונה microarray שקופיות על ידי סריקת שקופיות
- לסרוק את השקופית באמצעות סורק microarray הקרינה ברזולוציה של 10 מיקרומטר. הגדרות לייזר ו PMT צריך להיות חזק ככל האפשר, אך לא במקום הרוויה הוא ציין.
9. נתונים כריה ניתוח
- פתח את התמונה ArrayPro 3.2. הגדרת תבנית המערך על פי המפה מציגה את מערך כתמים במקומות נוגדנים. בזהירות ליישר כל עיגול בתבנית על המקום המתאים בתמונה.
- חלץ את העוצמה של כל מקום לקובץ Excel לניתוח נוסף.
10. נציג תוצאות
לדוגמא ניסוי 1
Glycosylation פרופיל של גליקופרוטאינים בסרום מספר במדגם קרצינומה של המטופל hepatocellular בסרום באמצעות microarray הנוגדן חסם כימית עם זיהוי לקטינים נפוצה.
מטרת הניסוי היא לחקור את הפרופיל glycosylation הפרט של 20 גליקופרוטאינים של קרצינומה hepatocellular (HCC) מדגם בסרום החולה באמצעות microarray הנוגדן חסם כימית עם זיהוי lectin. Microarray נוגדנים, המכיל 48 subarrays זהים הכוללים 26 נוגדנים ביוטין-BSA, תוכנן ומיוצר כמתואר STEP 1. אלה היו 26 נוגדנים נגד 20 גליקופרוטאינים בסרום כי המזוהים מבטיחים ערך אבחון מוקדם של חולים HCC באמצעות immunoprecipitation מבוסס lectin בשילוב עם זיהוי המוני חלבון spectrometric 12, 32, כפי שמוצג בטבלה 1. דפוס סידור המקומות נוגדנים מודפסים בשלושה עותקים ב subarray נציג אחד מוצגות באיור 1E ו 1F, בהתאמה. שתי שקופיות microarray זהים, לא היה חסום מבחינה כימית (איור 1 א), ואילו השני היה (איור 1 ב), שימשו לבצע את אותו ניסוי פרופיל glycosylation על מנת להמחיש את חשיבות הליך כימי חסימת לניתוח. עבור השקופית חסם כימית (איור 1 ב), הניסוי התחיל שלב 2: כי לא חסם את השקופית כימית (איור 1 א), הניסוי החל משלב 3. הניסוי בוצע על ידי followinגרם כל השלבים המתוארים בפרוטוקול, למעט שלב 5.1.2 ו 6.1.2. בשלב 5.2, מדגם PBST0.1 השליטה יושם על subarrays בעמודה 1, 3, ו מדגם נקווה סרום HCC היה מוחל על subarrays בעמודה 2 ו -4, בהתאמה (כפי שמוצג באיור 1G). השוואה זו היא להראות את האפקטיביות, היעילות של ההליך, כמו גם את הזיקה אנטיגן המחייב של הנוגדנים לאחר כימית חוסם. 22 biotinylated לקטינים (כפי שניתן לראות בלוח 1) ספציפי כדי glycans שונים 18, 20 שהוחלו על כל subarray כפי שמוצג באיור 1G על פרופיל glycosylation. תמונות של (איור 1 א) microarrays חסומים כימית (איור 1 ב) וחסמו הלא כימי לאחר assay glycosylation פרופיל ידי ביצוע הפרוטוקול. כפי שניתן לראות את subarrays בעמודה 1 ו -3 הלא כימית microarrays חסומים (איור 1 א ', איור 1 ג), שבורק PBST0.1 יושמה, רוב לקטינים חייב לתפוס הנוגדנים, והראה רקע גבוהה מאוד דומים לאלה subarrays בעמודה 2 ו - 4, שבו המדגם סרום יושמה. אי אפשר להשיג מידע בפרופיל glycan משקופית זו microarray. נהפוך הוא, כאשר את אותו הניסוי נעשה על שקופית חסם כימית microarray נוגדנים, את subarrays בעמודה 1 ו 3, שבו רק PBST0.1 יושמה, רוב לקטינים הראה איגודי אין או נמוכה מאוד לתפוס נוגדנים, ואילו גבוהה אנטיגן איגודי נצפו עדיין בעמודה 2 ו - 4 ב subarrays, שבו מדגם בסרום יושמה (איור 1 ב 'ו 1D). התוצאה הראתה אלה הליך כימי חסימת היה שלב קריטי לפני מדידת glycans על נוגדנים שנתפסו גליקופרוטאינים. על ידי ביצוע הפרוטוקול, פרופילים glycosylation של 22 גליקופרוטאינים ב HCC בסרום ניתן להשיג.
ניסוי 2
מסך fucos שינוylation על גליקופרוטאינים בסרום ספציפיים כמו סמנים ביולוגיים שחמת הכבד מופלים ו קרצינומה חולים hepatocellular.
מטרת הניסוי הזה היא המסך fucosylation שונה על גליקופרוטאינים בדם סמנים ביולוגיים ספציפיים כמו המפלים שחמת הכבד קרצינומה hepatocellular (HCC) חולים. שונה ניסוי 1, שבו רק דגימה אחת סרום יושם על subarrays כל נחקר עם לקטינים שונים, assay זה, בסך הכל 40 דגימות נסיוב שונים HCC ו שחמת חולים יושמו על subarray כל אחד, נחקר עם lectin 1 (אאל ). ניתוחים סטטיסטיים, כגון T הבדיקה, מקלט פעולה (ROC) עקומת אופייני, נעשה כדי להעריך את הפצות או ביצוע אבחון של epiptope סמן glycan / חלבון על כל אדם בכל דגימות סרום. השתמשנו microarray נוגדנים מיוצרים באותו ניסוי 1 חוץ נגד CA19-9 ואנטי לואיס נוגדנים צילומי במחקר זה. Experiment בוצע מתוך 2 ספטמבר לשלב 9 למעט שלב 5.1.1 ו 6.1.1. סה"כ 40 דגימות נסיוב של שחמת הכבד 20 ו -20 חולים HCC יושמו ב subarray אקראית של 48 subarrays יחד עם דגימות PBS בקרה כביקורת שלילית. Fucosylation של כל החלבונים שנתפסו זוהה לאחר מכן באמצעות lectin biotinylated Fucose ספציפי. התמונה microarray שמוצג באיור 1 הפגינו אאל lectin מחויב רק חלבונים בדם שנתפסו על microarray (איור 2 ד) במקום נוגדנים שנתפסו (2E איור). עוצמות את הקישור אאל של כל הנקודות הוצאו אז, ניתח באמצעות T הבדיקה עקומות ROC כדי להעריך את הביצועים של fucosylation (עוצמת מחייב אאל) של כל חלבון בסרום על אפליה בין HCC וקבוצות שחמת. התוצאות הראו כי fucosylation של חלבון GP73 נתן את האפליה הטובה ביותר בין שתי הקבוצות עם p = 0.03 ו-האזור מתחתהעקומה של עקומת ROC שווה ל 0.72. ניסוי זה הוכיח בהליך זה היא שיטה מהירה, יעילה לסינון glycan epitope / סמן על דוגמאות רבות בתוך חלבונים רבים.
תעודת זהות | שם מגיב | קיצור | חברה | קטלוג # |
L1 | Concanavalin Biotinylated | ConA | וקטור מעבדות | BK-1000 |
L2 | Lectin Biotinylated Sambucus nigra | SNA | וקטור מעבדות | B-1305 |
L3 | Biotinylated עדשה Culinaris Agglutinin | רע"א | וקטור מעבדות | BK-2000 |
L4 | Biotinylated Ricinus communis Agglutinin אני | RCA | וקטור מעבדות | BK-1000 |
L5 | Lectin Biotinylated Aleuria Aurantia | אאל | וקטור מעבדות | B-1395 |
L6 | Lectin Biotinylated Erythrina Cristagalli | ECL | וקטור מעבדות | BK-3000 |
L7 | Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | GSL ב ' | וקטור מעבדות | BK-3000 |
L8 | Biotinylated נבט חיטה Agglutinin | WGA | וקטור מעבדות | BK-1000 |
L9 | Biotinylated vulgaris Phaseolus Erythroagglutinin | PHA-E | וקטור מעבדות | BK-2000 |
L10 | Biotinylated vulgaris Phaseolus Leucoagglutinin | PHA-L | וקטור מעבדות | BK-2000 |
L11 | ביובוטנים tinylated Agglutinin | הרשות הפלסטינית | וקטור מעבדות | BK-1000 |
L12 | Biotinylated Pisum sativum Agglutinin | PSA | וקטור מעבדות | BK-2000 |
L13 | Biotinylated לבלב Biflorus Agglutinin | DBA | וקטור מעבדות | BK-1000 |
L14 | ב"דאטורה Biotinylated וסטרמוניום Lectin | DSL | וקטור מעבדות | BK-3000 |
L15 | Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | SJA | וקטור מעבדות | BK-2000 |
L16 | סויה Biotinylated Agglutinin | SBA | וקטור מעבדות | BK-1000 |
L17 | Biotinylated Solanum Tuberosum (תפוחי אדמה) Lectin | STL | וקטור מעבדות | BK-3000 </ Td> |
L18 | Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin אני | אני GSL | וקטור מעבדות | BK-2000 |
L19 | Lectin Biotinylated בקיה Villosa | VVL | וקטור מעבדות | BK-2000 |
L20 | Biotinylated Lycopersicon Esculentum (עגבניות) Lectin | לל | וקטור מעבדות | BK-3000 |
L21 | Ulex Biotinylated Europaeus Agglutinin אני | אני UEA | וקטור מעבדות | BK-1000 |
L22 | Biotinylated Jacalin | JACALIN | וקטור מעבדות | BK-3000 |
A1 | F עיזים ("א.ב.) 2 נגד אדם IgM שבר, נוגדנים Fc5μ | IgM | ג'קסון חיסונית מחקר | 109-006-129 |
A2 | החמור F ('א.ב.) 2Frag נגד אדם IgG (H + L) נוגדן | Ab1 | ג'קסון חיסונית מחקר | 709-006-149 |
A3 | עכבר נגד אדם IgG ו '("א.ב.) 2 נוגדנים חד שבטיים | AB3 | ג'קסון חיסונית מחקר | 209-005-097 |
A4 | אנטי אנושי עז אלפא 2 macroglobulin polyclonal נוגדנים | A2M | GeneTex | GTX62924 |
A5 | הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים | A1AT | לי Biosiences | CA1T-80A |
A6 | נגד אדם מאוס Alpha-1-antitrypsin נוגדנים חד שבטיים | A1AT | סיגמא אולדריץ' | SAB4200198 |
A7 | הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים | מערכה | NeoMarkers | RB-367-A1 |
A8 | הארנב נגד אדם אלפא-1-מגוחכיםhymotrypsin polyclonal נוגדנים | מערכה | פישר סיינטיפיק | RB9213R7 |
A9 | נגד אדם מאוס transferrin חד שבטי נוגדן | Transferrin | GeneTex | GTX101035 |
A10 | הארנב נגד אדם transferrin polyclonal נוגדנים | Transferrin | GeneTex | GTX77130 |
A11 | אנטי אנושי עז אפוליפופרוטאין J polyclonal נוגדנים | ApoJ | Abcam | ab7610 |
A12 | נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן | GP73 | אבוט | 14H4-23 |
ת 13 | נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן | GP73 | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה INC | SC-101275 |
A14 | הארנב נגד אדם אלפא 1 fetoprotein polyclonal נוגדנים | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
ת 15 | נגד אדם מאוס Alpha-1 fetoprotein חד שבטי נוגדן | AFP | פיצג'רלד | 10-A05A |
A16 | נגד אדם מאוס hemopexin חד שבטי נוגדן | Hemopexin | Assaypro | 60190-05011 |
A17 | עכבר נגד אדם glypican-3 (1G12) נוגדנים חד שבטיים | GPL3 | סנטה קרוז ביו | SC-65443 |
A18 | נגד אדם מאוס Kininogen (LMW) נוגדנים חד שבטיים | Kininogen | Assaypro | 20333-05011 |
A19 | הארנב נגד אדם MMP-21 חד שבטי נוגדן | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
A20 | נגד אדם מאוס CEACAM-1 נוגדנים חד שבטיים | CEACAM | מחקר ופיתוח מערכות | MAB1180 |
21 | עכברוש נגד האדם נוגדנים חד שבטיים DPPIV/CD26 | DPPIV | מחקר ופיתוח מערכות | MAB22441 |
A22 | נגד אדם מאוס PIVKA II נוגדנים חד שבטיים | PIVICA | קריסטל כימית | 8040 |
A23 | נגד carcinoembryonic עכבר אנטיגן | CEA | ארה"ב הביולוגי | C1300 |
A24 | עכבר נגד CA125 סרטן Antigen | CA125 | ארה"ב הביולוגי | C0050-01D |
A25 | נגד CA19-9 סרטן עכבר אנטיגן | CA19-9 | ארה"ב הביולוגי | C0075-18 |
A26 | נגד לואיס עכבר x חד שבטי נוגדן | לואיס X | Calbiochem | 434631 |
ביו | Biotinylated BSA (בקרה חיובית) | ביו | תוצרת בית | N / A |
1. השולחן רשימת לקטינים ונוגדנים שימוש בפרוטוקול זה.
שם / s מגיב ציוד | חברה | מספר קטלוגי |
ללא מגע microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
384 microplate | דיג | 14-230-243 |
FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
Ultrathin nitrocellulose coate microarray שקופיות | Gentel | PATH |
Slide Imprinter (לא חובה) | החברה ג'ל | WSP60-1 |
מטרף | דיג | 15-453-211 |
סרכזת | Eppendorf | 5804 000.013 |
החלק כביסה אגן / שקופיות תבשיל מכתים Wiה נשלף ארון תקשורת | דיג | 08-812 |
הדגירה שקופיות תא / מיקרוסקופ שקופיות תיבת | דיג | 03-448-5 |
Brij 35, 30 W / V הפתרון% במים | Acros Organics | AC32958-0025 |
Tween-20 | דיג | P337-100 |
נתרן Periodate (NaIO 4) | סיגמא | 311448 |
L-גלוטמית חומצה γ-hydrazide | סיגמא | G-7257 |
אצטט וסודיום (CH 3 COONa) | סיגמא | S2889 |
שור סרום אלבומין (BSA) | Lampire ביולוגית Labs | 7500804 |
מאגר מלוחים פוספט (PBS) (10X) | Denville מדעי | CP4390-48 |
Dylight 549 מצומדות NeutrAvidin | Thermo | 22837 |
מעכבי פרוטאז קוקטייל טבליות | רוש | 4693159001 |
ChromPure האדם IgG, קטע Fc | ג'קסון Immunoresearch | 009-000-008 |
ChromPure לנוגדנים אנושיים, כל מולקולה | ג'קסון Immunoresearch | 009-000-003 |
ChromPure עכבר IgG, כל מולקולה | ג'קסון Immunoresearch | 015-000-003 |
ChromPure עכבר IgG, קטע Fc | ג'קסון Immunoresearch | 015-000-008 |
ChromPure הארנב IgG, כל מולקולה | ג'קסון Immunoresearch | 011-000-003 |
ChromPure חמור IgG, כל מולקולה | ג'קסון Immunoresearch | 017-000-003 |
Microarray סורק | טקאן | LS מחדש |
טבלה 2. רשימהשל ציוד ריאגנטים שימוש בפרוטוקול זה.
תוכנית 1 תוכנית המציגה את microarray נוגדנים lectin מבוסס גילוי סמן ביולוגי glycan תהליך 1 (שלב 2 עד 4): בלוק חוסם עם microarray נוגדנים (Glu-hydrazide) ו - BSA, 2 (שלב 5).. להחיל דגימות סרום וללכוד גליקופרוטאינים ספציפיים עם נוגדנים ספציפיים: 3 (שלב 6): להחיל lectin biotinylated (ים): 4 (שלב 7): בדיקה אאל biotinylated עם NeutrAvidin 549 Dylight מיועד לשימוש microarray הדמיה.
באיור 1. Microarray תמונות של פרופיל ניסוי לדוגמא glycosylation 1 של גליקופרוטאינים בסרום מספר במדגם החולה HCC בסרום באמצעות chemicברית חסם microarray נוגדנים עם זיהוי lectin נפוצה. שתי שקופיות microarray זהים, (א) לא חסום מבחינה כימית, או (ב) חסם כימית כמתואר בשלב 2, הן עברו את כל השלבים 2 עד 9 עבור פרופיל glycosylation, כמו גם למטרות השוואה. (א) ו - (ב) הם תמונות microarray סרק א 8 ב רזולוציה של 10 מיקרון. (ג) זום בתמונה של שתי השורות הראשונות של אף חסמו כימית שקופיות microarray (א) (ד) זום בתמונה של שתי השורות הראשונות של השקופית לא microarray חסם כימית (ב)); (ה) תרשים של ההסדר נוגדנים בתוך subarray כל אחד; (F) מפות מערך: מיקומו של נוגדנים בתוך כל subarray, כל שם מייצג נוגדנים 3 נקודות: (ז) מדגם סרום ומיקום lectin: כך עולה דיאגרמות אשר subarray כל מדגם בסרום lectin יושם על.
2. איור microarray תמונותהניסוי מדגם 2 מסך fucosylation שונה על גליקופרוטאינים בדם סמנים ביולוגיים ספציפיים כמו המפלים שחמת הכבד בחולים HCC. Assay microarray בוצע כמתואר בסעיף ניסוי 2 לדוגמא. (א) תמונה שלמה של שקופיות שקופיות microarray משלב 8 (ב) בתרשים ההסדר נוגדנים בתוך subarray זה: (ג) מערך: מפות מיקום של נוגדנים בתוך כל subarray, כל שם מייצג נוגדנים 3 נקודות; (ד) זום בתמונה של subarray שהיו מודגרות עם מדגם בסרום: (ה) זום בתמונה של subarray שהיו מודגרות עם PBS שליטה.
איור 3. תוצאות Glycan אפיון של הניסוי מדגם 1. כל גרף עמודות מייצגים פרופיל מחייב lectin (או פרופילים glycan) של אחד חלבון 20 במבחן. סך הכל 22 לקטינים שונים שימשו לניתוח הדואר glycan פרופיל של כל חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. היעד חלבון נוגדן הבחירה ללכוד
לפני assay microarray נוגדנים, חומרים כימיים וחומרים מסוימים יש צורך לקחת בחשבון ומוכן. לעצב microarray נוגדנים עבור פרופיל glycan או סמן ביולוגי glycan ההקרנה, פאנל של נוגדנים ספציפיים למועמדים גליקופרוטאין צריך להיקבע על פי הספרות או תוצאות קודמות. נוגדנים אלה נרכשו בדרך כלל מיצרנים שונים, כגון מחקר ופיתוח מערכות וכו 'IgGs עדיפים נוגדנים ללכוד מאז הבדיקות הקודמות שלנו הראו כי חלק IgM ו-IgE עלול לאבד לחלוטין את זיקות מחייבות אנטיגן שלהם לאחר שינוי כימי.
2. עיצוב וייצור של נוגדנים microarray
ייצור של נוגדנים microarray היא צעד אופציונלי אשר צריך microarrayer מקצועי יקר, מאומנים היטב אנשי לפעולה. עם זאת, אישית נוגדנים microarray תעשייהture ניתן לעשות זאת בקלות מספק שירותים כגון Serome Biosciences בע"מ לתוצאה חזקים, אנו ממליצים microarrayer ללא מגע, כגון נפח sciFLEXARRAYER Scienion אולטרה נמוכה ללא מגע microarrayer ששימש בייצור נוגדנים שלנו microarray. גבוה מחייב microarray קיבולת שקופיות, כגון הנתיב (Gentel ביו בע"מ WI) או שקופיות H (Shott, הרשות הפלסטינית).
3. בחר ולהכין חלבונים מחייב Glycan (Gbps) על פרופיל glycosylation
Gbps כי היעד שונה מונו או אוליגוסכרידים ניתן למצוא בספרות והן באמצעות מנוע החיפוש שפותח על ידי מעבדת Haab 29 ומתוחזק במכון Genomics Translational כדי לבחור Gbps עם סגוליות זיקה גבוהה וכדיאת אפיטופים glycan ממוקדות, בחר את המוטיב (epitope) מתוך התפריט הנפתח ולחץ על "חיפוש". ספציפית Gbps ל מוטיב זה (epitope) יירשם לפי שווי logP שלהם גבוהה לסדר נמוכה. גבוה logP עולה זיקה מחייבת חזק וספציפיות כדי מוטיב glycan / epitope. עקב בעיה לא מוגדרת הטבועה מחייב מ lectin, שיטה זו עדיין אינה אופטימלית כמו assay המבוסס על נוגדנים. לכן, אנו ממליצים בחום נגד glycan נוגדנים משמשים, כגון אנטי לואיס X או נגד sialyl לואיס נוגדנים, אם הם זמינים. השימוש Gbps מרובים לאיתור עוד אסטרטגיה לחצות לבדוק פרופילים מחייב שונים כדי לקבל נתונים אמינים מחייב.
4. ניתוח נתונים
כי שיטה זו משמשת כדי לזהות חלבונים בסרום מקומיים, חלבונים מתחמי יכול להיות בשבי זוהה. המערבי כתם או ספקטרומטריית מסה הוא שיטות טובות כדי לאמת את נתוני microarray. בינתיים, זיהוי של רמות החלבון באמצעות microarray אותו היא שיטה אחרת, ללמוד את הפרטים של שינוי glycosylation של חלבון, כגון האם השינויים הם תוצאה של שינוי רמת סך החלבון או סתם כי רמת glycosylation עלה על כל אחד החלבונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הפטיטיס ומחקר וירוס.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biotinylated Concanavalin A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA |
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
Biotinylated Peanut Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA |
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
Biotinylated Datura Stramonium Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
Biotinylated Soybean Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
Biotinylated Vicia Villosa Lectin | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
Biotinylated Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 | JACALIN |
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody | GeneTex | GTX62924 | A2M |
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | Lee Biosiences | CA1T-80A | A1AT |
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | NeoMarkers | RB-367-A1 | ACT |
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody | GeneTex | GTX101035 | Transferrin |
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody | GeneTex | GTX77130 | Transferrin |
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody | Abcam | ab7610 | ApoJ |
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody | Assaypro | 60190-05011 | Hemopexin |
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody | Crystal chem | 8040 | PIVICA |
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen | US biological | C1300 | CEA |
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen | US biological | C0050-01D | CA125 |
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen | US biological | C0075-18 | CA19-9 |
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
Biotinylated BSA (positive control) | Home-made | N/A | Bio |
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol. | |||
Non contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
384 microplate | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides | Gentel | PATH | |
Slide Imprinter (optional) | The Gel Company | WSP60-1 | |
Shaker | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 000.013 | |
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
Slide incubation chamber/microscope slide box | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
Brij 35, 30 w/v% solution in water | Acros Organics | AC32958-0025 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
Sodium Periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
L-Glutamic acid γ-hydrazide | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Group | 4693159001 | |
ChromPure Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
ChromPure Mouse IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
ChromPure Donkey IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
Microarray Scanner | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol. |
References
- Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
- Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
- Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
- Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
- Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
- Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
- Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
- Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
- Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
- Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
- Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
- Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
- Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
- Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
- Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
- Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
- Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
- Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
- Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
- Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
- Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
- Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
- Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
- Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
- Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
- Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
- Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
- Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
- Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
- Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
- Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).