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Biology

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

doi: 10.3791/3791 Published: May 4, 2012

Summary

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Protocol

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1. Imprimir um microarray de anticorpos para o Ensaio

  1. Diluir todos os anticorpos para 0,5 mg / ml em solução salina de tampão fosfato, pH 7,2 (PBS).
  2. Alíquota 40 uL de cada anticorpo na placa de fonte 384 poços.
  3. Coloque a placa de fonte de 384-bem para o microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
  4. Carregar 20 lâminas de microarray PATH para o microarrayer como alvo.
  5. Defina o microarrayer para imprimir 48 subarrays idênticas, em que 27 anticorpos e proteínas de controle são vistos em triplicado em um padrão 9x9 (Figura 1E, 1F).
  6. Inicie o microarrayer para imprimir os slides microarray de anticorpos.
  7. Colete as lâminas de microarray de anticorpos, e armazená-los em lâminas cassete com dessecante. Aspire selar a cassete em um saco plástico usando vácuo sealer (FoodSaver).
  8. Armazenar as lâminas microarray seladas a 4 ° C no frigorífico.

2. Quimicamente Bloquear o microarray de anticorpos para Prevenir GBPLigação aos anticorpos de captura

O ensaio é iniciado microarray uma vez que as lâminas microarray são quimicamente bloqueado e dura cerca de 8 horas. Uma vez iniciado o ensaio de microarray tem de ser concluída (Passos 2 a 8).

  1. Leve o microarray desliza para fora da geladeira, e equilibrar-los à temperatura ambiente por 30 minutos.
  2. Remover a corrediça a partir da caixa de armazenamento e brevemente enxagúe em tampão fosfato pH 7,2 salina com 0,1% de Tween 20 (PBST0.1) uma vez em uma lâmina de lavagem bacia e, em seguida, em 15 mM de tampão acetato de sódio pH 5,0 com 0,1% de Tween (CBT0 .1) de uma forma sequencial. Incubar as lâminas em CBT0.1 durante 10 minutos em bacia lâmina de lavagem.
  3. Prepare 150 mM fresco NaIO 4 em 15 mM tampão acetato de sódio pH 5,0 (CB), e mantê-lo em em um slide lavatório em um refrigerador, evitando a luz antes do uso.
  4. Remova a lâmina do CB, e colocá-lo na bacia contendo NaIO fresco 4 com o lado de anticorposvoltada para cima. Cobrir a bacia com folha de alumínio para evitar a luz, e incubar a bacia corrediça durante 2 horas com agitação suave a 4 ° C num frigorífico.
  5. Preparar 300 mL de 10 mM de ácido glutâmico hidrazida (o bloqueador) em CB.
  6. Remover o slide da bacia, e lave-o brevemente no CB 3 vezes durante 5 minutos de cada vez na bacia de slides de lavar roupa.
  7. Incubar as lâminas no bloqueador numa bacia de lavagem durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave.
  8. Retire as lâminas da bacia, e lavá-los com PBST0.1 por 3 minutos.

3. Bloquear ligações não específicas para o Microarray com albumina de soro bovino (BSA)

  1. Preparar 300 ml de BSA a 1% em tampão fosfato pH 7,2 com Tween salina a 0,5% (PBST0.5) numa bacia lâmina de lavagem, e incubar a corrediça microarray na bacia durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave.
  2. Lavam-se as lâminas em PBST0.1 três vezes durante 3 minutos de cada vez.
  3. Coloque o slideem um porta-lâminas, e centrifugação a 1.200 xg em uma centrifugação durante 2 minutos para secar a corrediça microarray.

4. Imprint Grade cera para o slide Microarray para separar cada subarray

  1. Pré-aquecimento do impressor de cera, a 70 ° C durante 5 minutos.
  2. Carregue a lâmina de microarray bloqueado no imprinter cera com anticorpo lado virado para a cera. Puxe delicadamente a alça de cera marca na lâmina uniformemente.

5. Aplicar amostras de soro para o slide Microarray

  1. Durante o Passo 2.4, preparar amostras de soro para qualquer ensaio de perfil glico em uma amostra (5.1.1), ou único glico medição epiptope entre várias amostras (5.1.2).
    1. Em uma experiência para os profilings glicano de múltiplas glicoproteínas em uma amostra de soro usando GBPs múltipla (ver exemplo de experimento 1), uma amostras de soro irá ser aplicado sobre todos os subarrays. Neste caso, 40 uL ampla soro é diluído em 360 ul de PBS contendo 0,1%Tween-20, 0,1% de Brij 35, 100 ug / mL de IgG de rato, 100 ug / mL de rato IgG, 100 ug / mL de IgG de coelho, 100 ug / mL de IgG de cabra e 100 ug / ml de burro IgG. Este volume é suficiente para a aplicação de 6 uL de solução de soro diluído em cada subarray.
    2. Em uma experiência para a medição de glicano um em várias proteínas séricas entre múltiplas amostras de soro utilizando um detecções GBP (ver experiência amostra 2). Neste caso, 1 ul ampla soro é diluído em 9 ul de PBS contendo 0,1% de Tween-20, 0,1% de Brij 35, 100 ug / mL de IgG de rato, 100 ug / mL de rato IgG, 100 ug / mL de IgG de coelho , 100 ug / mL de IgG de cabra e 100 ug / mL de burro IgG. Este volume é suficiente para a aplicação de 6 uL de solução de soro diluído em cada subarray.
  2. Após impressão de cera no Passo 4, cuidadosamente aplicar 6 uL das amostras diluídas ou amostras de controlo (PBST0.1) para cada subarray da lâmina. Incubar a lâmina em um cassete umidificado com toalhas de papel molhadas em temperatura ambientedurante 1 hora.
  3. Lavar a lâmina com PBST0.1 três vezes para 3 minutos de cada vez.
  4. Secar a lâmina girando-o em 1200 xg por 2 minutos.

6. Aplicar GBP biotinilado (anticorpo ou Lectina Anti-glicano) para o slide

  1. Durante o Passo 2.4, preparar 10μg/ml de lectinas biotiniladas / Gbps em PBST0.1.
    1. Em glicano experimento perfil que sonda uma amostra com lectinas múltiplos (exemplo de experimento 1), preparar 350 uL de lectina biotinilada que é suficiente para todos os subarrays.
    2. Em único epítopo de triagem / biomarcador glicano em amostras múltiplas usando lectinas múltiplas, preparar 10 uL de cada lectina biotinilado que é suficiente para uma subarray.
  2. Aplicar 6 uL da lectina diluída biotinilado (s) para cada subarray da lâmina, e incubar na caixa corrediça humidificada com toalhas de papel molhado à temperatura ambiente durante 1 hora.
  3. Lavar as lâminas com PBST0.1 três vezes por 3 minutos cada time.
  4. Secar a lâmina girando-o em 1200 xg em centrífuga de 2 minutos.

7. Aplicar NeutrAvidin Identificada Dye para detecção da fluorescência

  1. Prepare-se 350 uL de Dylight NeutrAvidin 549 rotulado que é suficiente para todos os subarrays.
  2. Aplicar 6 uL de Dylight NeutrAvidin 549 rotulados para cada subarray, e incubar a lâmina na cassete de corrediça humidificada à temperatura ambiente durante 1 hora.
  3. Lavar a lâmina com PBST0.1 três vezes para 3 minutos de cada vez.
  4. Secar a lâmina girando a ele em 1200 xg em centrífuga de 2 minutos.

8. Obter Microarray de corrediça da imagem por varredura do Slide

  1. Digitalização do slide usando um scanner de microarray de fluorescência em resolução de 10 mM. Os parâmetros utilizados e PMT deve ser o mais forte possível, mas nenhum ponto de saturação é observado.

9. Extração de dados e análise

  1. Abra a imagem no ArrayPro 3.2. Configure o modelo de matriz de acordo com o mapa matriz que mostra os pontos dos locais de anticorpos. Cuidadosamente alinhar cada círculo do molde para o ponto correspondente na imagem.
  2. Extrai-se a intensidade de cada mancha em um arquivo Excel para análise posterior.

10. Os resultados representativos

Experimento Amostra 1

Perfil de glicosilação de múltiplas glicoproteínas em hepatocelular amostra do paciente carcinoma soro usando microarray anticorpo quimicamente bloqueada com detecção lectinas múltipla.

O objetivo deste experimento é explorar o perfil de glicosilação indivíduo de 20 glicoproteínas no carcinoma hepatocelular (HCC) amostra de soro do doente através de microarray de anticorpos quimicamente bloqueada com detecção de lectina. Um microarray anticorpo, que contém 48 subarrays idênticos que incluem anticorpos e 26 biotina-BSA, foi concebido e produzido como descrito em Step 1. Estes anticorpos foram 26 contra 20 glicoproteínas que identificados como promissores valor diagnóstico precoce para pacientes com carcinoma hepatocelular usando imunoprecipitação baseado lectina combinada com a identificação da proteína de massa por espectrometria de 12, 32 como mostrado na Tabela 1. O padrão e disposição dos pontos de anticorpos impressas em triplicado em um subarray representativo são apresentados na Figura 1E e 1F, respectivamente. Duas lâminas microarray idênticos, não era um quimicamente bloqueado (Figura 1A), enquanto o outro foi (Figura 1B), foram utilizados para realizar a experiência de perfis mesmo glicosilação, a fim de demonstrar a importância do procedimento quimicamente de bloqueio para a análise. Para a corrediça quimicamente bloqueado (Figura 1B), a experiência começou no Passo 2; para a nenhum corrediça quimicamente bloqueado (Figura 1A), o experimento iniciado a partir do Passo 3. O experimento foi conduzido por following todos os passos descritos no protocolo exceto para a etapa 5.1.2 e 6.1.2. No Passo 5,2, uma amostra de controlo PBST0.1 foi aplicada sobre subarrays na coluna 1 e 3, e um pool HCC amostra de soro foi aplicado sobre subarrays na coluna 2 e 4, respectivamente (como mostrado na Figura 1G). Esta comparação é o de mostrar a eficácia, a eficiência do processo, bem como a afinidade de ligação ao antigénio dos anticorpos após quimicamente bloqueio. 22 lectinas biotinilado (como mostrado na Tabela 1) que específico para glicanos diferentes 18, 20 foram aplicadas em cada subarray como mostrado na Figura 1G para perfilação de glicosilação. Imagens das quimicamente bloqueados (Figura 1B) e não-bloqueado quimicamente (Figura 1A) microarrays após o ensaio de perfil de glicosilação, seguindo o protocolo. Como mostrado nas subarrays na coluna 1 e 3 em não-quimicamente microarrays bloqueados (Figura 1A e Figura 1C), sobre as quaisapenas PBST0.1 foi aplicada, a maioria das lectinas ligado para capturar os anticorpos, e mostrou fundo muito elevada que comparável aos subarrays na coluna 2 e 4, em que a amostra de soro foi aplicado. É impossível obter informações de perfil de glicano este slide microarray. Pelo contrário, quando a mesma experiência foi realizada sobre uma lâmina quimicamente bloqueada anticorpo microarray, os subarrays na coluna 1 e 3, sobre os quais é apenas PBST0.1 foi aplicada, a maioria das lectinas mostrou ligações nenhum ou muito baixo para capturar os anticorpos, enquanto que o antigénio de alto ligações foram ainda observados em subarrays na coluna 2 e 4, em que foi aplicada amostra de soro (Figura 1B e 1D). Estes resultados mostraram o procedimento quimicamente bloqueio foi um passo crítico tona a medição de glicanos de anticorpo capturado glicoproteínas. Seguindo o protocolo, os perfis de glicosilação de 22 glicoproteínas em CHC soro pode ser obtida.

Experimento 2

Tela para fucos alteradosylation em glicoproteínas específicas como biomarcadores para cirrose hepática discriminadas e pacientes com carcinoma hepatocelular.

O objetivo deste experimento é a tela para fucosilação alteradas em glicoproteínas específicas como biomarcadores que discriminam cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (HCC) pacientes. Diferente da Experiência 1, em que apenas uma amostra de soro foi aplicado sobre a cada subarrays e sondadas com lectinas vários, neste ensaio, o total de 40 diferentes amostras de soro de HCC e cirrose pacientes foram aplicadas em cada subarray, e sondado com um lectina (AAL ). A análise estatística, tais como teste T, receiver operating-curva característica (ROC), foi feito para avaliar a distribuição ou a realização de diagnóstico da epiptope glicano / biomarcador em cada proteína individual em todas as amostras de soro. Utilizou-se o mesmo anticorpo microarray fabricado na Experiência 1, com excepção para o anti-CA19-9 e anticorpos anti-Lewis X neste estudo. O experiment foi realizado de 02 de setembro para o Passo 9, exceto para o Passo 5.1.1 e 6.1.1. Total de 40 amostras de soro de 20 cirrose e 20 pacientes com carcinoma hepatocelular foram aplicados em subarray aleatória dos 48 subarrays, juntamente com as amostras de controlo de PBS como controlo negativo. Fucosilação de cada proteínas dos capturados foi então detectada usando lectina-fucose específico biotinilado. A imagem microarray mostrado na Figura 1 demonstram a AAL lectina apenas ligada a proteínas séricas capturadas no microarray (Figura 2D) em vez de anticorpos capturados (Figura 2E). As intensidades AAL de ligação de todas as manchas foram então extraídos e analisados ​​usando teste T e as curvas de ROC para avaliar o desempenho do fucosilação (intensidade de ligação AAL) de cada proteína de soro sobre a discriminação entre os grupos e HCC cirrose. Os resultados mostraram que a proteína GP73 de fucosilação deu a melhor discriminação entre os dois grupos com p = 0,03 e área sob acurva da curva de ROC igual a 0,72. Esta experiência demonstrou este procedimento é um método rápido e eficiente para o rastreio de glicano epítopo / biomarcador em amostras múltiplas dentro múltiplas proteínas.

ID Nome do reagente Abreviatura Companhia Catalogo
L1 Concanavalina A biotinilado ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Biotinilado Sambucus Nigra Lectina SNA Vector Laboratories B-1305
L3 Biotinilado Lens culinaris aglutinina LCA Vector Laboratories BK-2000
L4 Biotinilado Ricinus communis aglutinina eu RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Biotinilado Aleuria Lectina Aurantia AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Biotinilado Erythrina Lectina Cristagalli ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Lectina Simplicifolia II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Biotinilado Gérmen de Trigo aglutinina WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Erythroagglutinin vulgaris biotinilado Phaseolus PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Leucoagglutinin vulgaris biotinilado Phaseolus PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 Bioaglutinina de amendoim tinylated PNA Vector Laboratories BK-1000
L12 Biotinilado Pisum sativum aglutinina PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Biotinilado Dolichos biflorus aglutinina DBA Vector Laboratories BK-1000
L14 Lectina Stramonium biotinilado Datura DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Aglutinina Sophora Japonica biotinilado SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Aglutinina de soja biotinilado SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Biotinilado Solanum tuberosum (Batata) Lectina STL Vector Laboratories BK-3000 </ Td>
L18 Biotinilado griffonia simplicifolia Lectina (Bandeiraea) I Eu GSL Vector Laboratories BK-2000
L19 Biotinilado Vicia Lectina Villosa VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Biotinilado Lycopersicon esculentum (tomate) Lectina LEL Vector Laboratories BK-3000
L21 Ulex biotinilado Europaeus aglutinina eu UEA I Vector Laboratories BK-1000
L22 Jacalina biotinilado Jacalina Vector Laboratories BK-3000
A1 F cabra (ab ') 2 Fragmento IgM anti-humana, o anticorpo Fc5μ IgM Jackson Immuno Research 109-006-129
A2 Burro F (ab ') 2Frag IgG anti-humano de anticorpo (H + L) AB1 Jackson Immuno Research 709-006-149
A3 De ratinho anti-IgG humana F (ab ') 2 de anticorpo monoclonal AB3 Jackson Immuno Research 209-005-097
A4 Cabra anti-humano alfa 2 macroglobulina anticorpo policlonal A2M GeneTex GTX62924
A5 De coelho anti-anticorpo humano alfa-1-antitripsina policlonal A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 De ratinho anti-anticorpo humano alfa-1-antitripsina monoclonal A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 De coelho anti-anticorpo humano alfa-1-antitripsina policlonal ACT Neomarkers RB-367-A1
A8 De coelho anti-humano de alfa-1-antichymotrypsin anticorpo policlonal ACT Fisher Scientific RB9213R7
A9 Rato anti-humana de anticorpo monoclonal de transferrina Transferrina GeneTex GTX101035
A10 De coelho anti-anticorpo humano policlonal de transferrina Transferrina GeneTex GTX77130
A11 Cabra anti-humano apolipoproteína anticorpo policlonal J ApoJ Abcam ab7610
A12 Rato anti-humana de GP73 anticorpo monoclonal GP73 Abbott 14H4-23
A13 Rato anti-humana de GP73 anticorpo monoclonal GP73 Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-101.275
A14 De coelho anti-anticorpo humano de alfa-1 fetoproteína policlonal AFP GenWay GWB-41C966
A15 De ratinho anti-anticorpo humano de alfa-1 fetoproteína monoclonal AFP Fitzgerald 10-A05A
A16 Rato anti-humana de anticorpo monoclonal hemopexina Hemopexina Assaypro 60190-05011
A17 Rato anti-humano glypican-3 (1G12) anticorpo monoclonal GPL3 Santa Cruz Bio sc-65.443
A18 Rato anti-humano Cininogênio anticorpo (LMW) monoclonal Cininogênio Assaypro 20333-05011
A19 De coelho anti-anticorpo humano MMP-21 monoclonal MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Rato anti-humano CEACAM-1 anticorpo monoclonal CEACAM R & D Systems MAB1180
A21 Rat anti-humano DPPIV/CD26 anticorpo monoclonal DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Rato anti-humano PIVKA anticorpo monoclonal II PIVICA Cristal chem 8040
A23 Antigénio de ratinho anti-carcinoembriónico CEA EUA biológica C1300
A24 Antigen de ratinho anti-CA125 Câncer CA125 EUA biológica C0050-01D
A25 Antigénio de ratinho anti-CA19-9 Câncer CA19-9 EUA biológica C0075-18
A26 De ratinho anti-Lewis anticorpo monoclonal x Lewis X Calbiochem 434631
bio Biotinilado BSA (controle positivo) Bio Home-made N / A

Lista Tabela 1. De lectinas e anticorpos utilizados neste protocolo.

Nome do reagente s / equipamentos Companhia Número de catálogo
Microarrayer sem contato BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplacas Pescador 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Nitrocelulose Ultrathin Coate microarray desliza Gentel PATH
Deslize Imprinter (opcional) A Companhia Gel WSP60-1
Sacudidor Pescador 15-453-211
Centrifugar Eppendorf 5804 000.013
Deslize lavatório / Slide Coloração Dish wiª removível rack Pescador 08-812
Deslize incubação caixa de lâminas câmara / microscópio Pescador 03-448-5
Brij 35, 30% de solução w / v em água Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Pescador P337-100
Periodato de sódio (NaIO4) Sigma 311448
Ácido L-glutâmico γ-hidrazida Sigma G-7257
De acetato de sódio anidro (CH 3 COONa) Sigma S2889
Albumina de soro bovino (BSA) Lampire Biológica Labs 7500804
Tampão fosfato salino (PBS) (10X) Denville Científico CP4390-48
Dylight NeutrAvidin 549 conjugado Thermo 22837
Protease Comprimidos Coquetel Inibidor Roche 4693159001
ChromPure IgG humana, fragmento Fc Jackson Immunoresearch 009-000-008
ChromPure IgG humana, molécula inteira Jackson Immunoresearch 009-000-003
ChromPure IgG de rato, molécula inteira Jackson Immunoresearch 015-000-003
ChromPure IgG de rato, fragmento Fe Jackson Immunoresearch 015-000-008
ChromPure IgG de coelho, molécula inteira Jackson Immunoresearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, molécula inteira Jackson Immunoresearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan LS Reloaded

Tabela 2. Listade equipamentos e reagentes utilizados neste protocolo.

Esquema 1
Esquema 1 Um esquema que mostra a microarray anticorpo lectina baseado glicano processo descoberta de biomarcadores 1 (Passo 2 a 4): Bloquear o microarray anticorpo com o bloqueador (Glu-hidrazida) e BSA; 2 (Passo 5):.. Aplicar amostras de soro e capturar glicoproteínas específicas com anticorpos específicos; 3 (Passo 6): aplicam lectina biotinilada (s), 4 (Passo 7): Sonda o AAL biotinilado com Dylight NeutrAvidin 549 rotulado para microarray de imagem.

A Figura 1
Figura 1. Imagens Microarray da Amostra perfil de glicosilação Experimento 1 de múltiplas glicoproteínas em HCC amostra de soro do doente usando chemicaliado bloqueado microarray de anticorpos com a detecção de lectina múltipla. Duas lâminas microarray idênticos, (a) nenhum quimicamente bloqueada, ou (B) quimicamente bloqueado, tal como descrito no Passo 2, ambos passou por todas as etapas de 2 a 9 para o perfil de glicosilação, bem como para fins de comparação. (A) e (B) são as imagens microarray digitalizada no Passo 8, em uma resolução de 10 micron. (C) o zoom na imagem das duas primeiras linhas da nenhum quimicamente bloqueada microarray corrediça (A), (D) o zoom na imagem das duas primeiras linhas da lâmina não microarray quimicamente bloqueado (B)); (E) o diagrama da disposição anticorpo dentro de cada subarray; (F) mapas de matriz: a localização de cada anticorpo dentro do subarray, cada nome de anticorpo representa 3 manchas; (G) da amostra de soro e localização lectina: mostra um diagrama que subarray cada amostra de soro e lectina foi aplicada sobre.

A Figura 2
Imagens Figura 2. Microarray doamostra experimento 2 tela para fucosilação alteradas em glicoproteínas específicas como biomarcadores que discriminam cirrose hepática e pacientes com carcinoma hepatocelular. O ensaio de microarray foi realizada como descrito no Exemplo de secção Experiência 2. (A) A imagem do slide conjunto da lâmina de microarray a partir do Passo 8; (B) o diagrama da disposição anticorpo dentro de cada subarray; (C) mapas de matriz: a localização de cada anticorpo dentro do subarray, cada nome de anticorpo representa 3 pontos; (D) um zoom-in imagem de um subarray que foram incubadas com amostra de soro, (E) um zoom-in imagem de um subarray que foram incubadas com PBS de controlo.

A Figura 3
Figura 3. Resultados da caracterização de glicanos exemplo de experimento 1. Cada gráfico de barras representam o perfil de lectina de ligação (ou perfis de glicano) de uma da proteína 20 testado. Total de 22 lectinas diferentes foram usados ​​para analisar the perfil de glicano de cada proteína.

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Discussion

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1. Proteína alvo e seleção anticorpo de captura

Antes do ensaio microarray anticorpo, alguns reagentes e materiais são necessários para ser considerado e preparado. Para conceber um microarray anticorpo para glicano perfil ou rastreio de glicano biomarcador, um painel de anticorpos específicos para os candidatos de glicoproteína deve ser determinada de acordo com a literatura ou a partir dos resultados anteriores. Esses anticorpos foram normalmente compradas de fornecedores diferentes, tais como R & D Systems etc IgGs são preferidos anticorpos de captura desde nossos testes anteriores mostraram que alguns IgM e IgE podem perder completamente suas afinidades de ligação ao antigénio após a modificação química.

2. Concepção e fabrico de microarray de anticorpos

Fabricação de microarray de anticorpos é um passo opcional que precisa microarrayer profissional e caro, e pessoal bem treinado para a operação. No entanto, personalizado anticorpo microarray fabricantetemperatura pode ser facilmente feito a partir de um prestador de serviços, tais como Serome Biosciences Inc. Para obter um resultado robusto, recomendamos uma microarrayer sem contato, como o volume de Scienion sciFLEXARRAYER ultra baixo sem contato microarrayer que foi usado em nossa fabricação microarray de anticorpos. Alta capacidade de ligação lâminas de microarray, como PATH (Gentel Bio Inc. WI) ou H Slide (Shott, PA).

3. Selecionar e preparar glicano Proteínas de Ligação (Gbps) para o perfil de glicosilação

GBPs que alvo diferente mono-ou oligossacáridos podem ser encontrados na literatura e através de um motor de pesquisa desenvolvido pelo laboratório Haab 29 e mantidas no Instituto translacional Genomics Para seleccionar GBPs com elevada especificidade e afinidade paraos epítopos glicano alvo, selecione o motivo (epítopo) a partir do menu drop-down, e clique em "pesquisar". O específico Gbps para este motivo (epítopo) serão listados de acordo com seu valor logP de alta para baixa ordem. Superior logP indica uma forte afinidade de ligação e especificidade para o tema glicano / epítopo. Devido ao problema não específica inerente de ligação de lectina, este método não é ainda como óptima como o ensaio de anticorpo com base. Assim, recomendamos que os anticorpos anti-glicano são utilizados, tais como anti-Lewis x ou anti-sialil Lewis alguns anticorpos, se eles estiverem disponíveis. Uso de GBPs múltipla para detecção é outra estratégia para cruzar diferentes perfis de ligação e de obter dados confiáveis ​​de ligação.

4. A análise dos dados

Uma vez que este método é usado para detectar nativas proteínas do soro, os complexos proteína-proteína pode ser capturado e detectado. Western blot ou espectrometria de massa é bons métodos para validar os dados de microarrays. Entretanto, A detecção de níveis de proteína usando o mesmo microarray é outro método para aprender os detalhes da alteração de glicosilação da proteína, tais como se as alterações eram devidas à variação total nível de proteína ou apenas que o nível de glicosilação aumentada em cada uma das proteínas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Pesquisa de Vírus Hepatite e.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

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References

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Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas
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Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

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