Summary
В этом исследовании мы опишем улучшение протокола мультиплексной высокой пропускной способности антител микрочипов с лектин метод обнаружения, которые могут быть использованы в гликозилирования профилирования специфических белков. Этот протокол имеет новый надежный реагентов и значительно сокращает время, стоимость и требования лабораторного оборудования по сравнению с предыдущей процедуры.
Protocol
1. Печать антител Microarray к анализу
- Развести все антитела к 0,5 мг / мл в фосфатном буфере солевой раствор, рН 7,2 (PBS).
- Алиготе 40 мкл каждого антитела в 384-и источник пластины.
- Загрузите 384-а источник пластины на microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
- Загрузить 20 слайдов PATH микрочипов на microarrayer как цель.
- Установить microarrayer печати 48 идентичных подрешеток, в которых 27 антител и контроль белки обнаружены в трех экземплярах 9x9 картина (рис. 1E, 1F).
- Начать microarrayer печатать слайды антител микрочипов.
- Соберите слайды антител микрочипов, и хранить их в слайдах кассету с осушителем. Вакуумное уплотнение кассеты в полиэтиленовый пакет с помощью вакуумного герметик (Foodsaver).
- Хранить запечатанные слайды микрочипов при 4 ° С в холодильнике.
2. Химически блокируют антитело Microarray по предотвращению GBPПривязка к Capture Антитела
Анализ микрочипов начинается, как только микрочипов слайды химически заблокировали и длится около 8 часов. После запуска микрочипов анализ должен быть завершен (шаги от 2 до 8).
- Возьмите микрочипов выдвигается из холодильника, и уравновешивать их в комнатной температуре в течение 30 минут.
- Удалить слайд из ящика, и кратко промойте их в фосфатный буфер солевом рН 7,2 с 0,1% Твин-20 (PBST0.1) один раз в режиме слайд-умывальником, а затем в 15 мМ буферного раствора ацетата натрия рН 5,0 с 0,1% Tween (CBT0 0,1) в последовательной форме. Инкубируйте слайды в CBT0.1 в течение 10 минут в слайд умывальника.
- Подготовить свежие 150 мМ NAIO 4 в 15 мМ буферного раствора ацетата натрия рН 5,0 (ЦБ), и держать его в в слайд умывальником в холодильнике, избегая при этом свет перед использованием.
- Удалить слайд из ЦБ, и положить его в миску со свежими NAIO 4 с антителами сторонывверх. Накройте бассейн с алюминиевой фольгой, чтобы избежать свет, и инкубировать слайд бассейна в течение 2 часов с нежным встряхивании при 4 ° С в холодильнике.
- Подготовить 300 мл 10 мМ гидразида глутаминовой кислоты (блокатор) в ЦБ.
- Удалить слайд из бассейна, а также кратко промойте его в ЦБ 3 раза по 5 минут каждый раз в слайд умывальника.
- Инкубируйте слайды окон в умывальником в течение 2 часов при комнатной температуре с нежным тряски.
- Удалить слайды из бассейна, и мыть их с PBST0.1 течение 3 минут.
3. Блок без привязки к конкретным Microarray с бычьего сывороточного альбумина (БСА)
- Подготовить 300 мл 1% BSA в фосфатный буфер солевом рН 7,2 с 0,5% Tween (PBST0.5) в режиме слайд-раковина, и инкубировать слайд микрочипов в бассейне в течение 1 часа при комнатной температуре, осторожно встряхивая.
- Промойте слайдов PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый раз.
- Положите слайдна слайде стойку, и спина в 1200 мкг на центрифугирования в течение 2 минут, чтобы высушить микрочипов слайдов.
4. Выходные данные Воск сетки на Microarray слайдов для разделения подмассива
- Предварительное нагревание воска импринтера при 70 ° С в течение 5 минут.
- Загрузите заблокирован микрочипов слайдов в воск импринтера с антителами стороной на воск. Осторожно потяните за ручку, чтобы отпечаток воска на слайде равномерно.
5. Применение образцов сыворотки на слайд Microarray
- В шаге 2.4, подготовить образцы сыворотки или для анализа глико профилей в одном образце (5.1.1), или один глико epiptope измерения между несколькими образцами (5.1.2).
- В эксперименте на гликана profilings несколько сыворотки гликопротеинов в одном образце сыворотки с помощью нескольких ГБ (см. пример эксперимент 1), образцы сыворотки будут применяться на всех подрешеток. В этом случае, 40 мкл сыворотки достаточно разводят на 360 мкл PBS, содержащего 0,1%Твин-20, 0,1% Бридж 35, 100 мкг / мл IgG мыши, 100 мкг / мл IgG крысы, 100 мкг / мл IgG кролика, 100 мкг / мл IgG козы и 100 мкг / мл IgG осла. Этот объем является достаточным для применения 6 мкл разбавленной сыворотки решение на каждый подмассива.
- В ходе эксперимента на одной гликана измерения на нескольких белков сыворотки крови у нескольких образцов сыворотки с помощью одного GBP обнаружения (см. пример эксперимент 2). В этом случае, 1 мкл сыворотки достаточно разводят в 9 мкл PBS, содержащего 0,1% Твин-20, 0,1% Бридж 35, 100 мкг / мл IgG мыши, 100 мкг / мл IgG крысы, 100 мкг / мл IgG кролика , 100 мкг / мл IgG козы и 100 мкг / мл IgG осла. Этот объем является достаточным для применения 6 мкл разбавленной сыворотки решение на каждый подмассива.
- После восковой отпечаток на шаге 4, бережно относиться 6 мкл разведенного образца или контрольных образцов (PBST0.1) для каждого подмассива слайда. Инкубировать слайд в увлажненном кассету с мокрыми полотенцами бумаги при комнатной температурев течение 1 часа.
- Промойте слайд с PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый раз.
- Высушите слайд вращая его в 1200 мкг в течение 2 минут.
6. Применить Биотинилированные GBP (лектина или Anti-гликана антител) на слайд
- В шаге 2.4, подготовить 10μg/ml биотинилированного лектинов / ГБ в PBST0.1.
- В эксперименте профилирования гликана что зонд одного образца с несколькими лектинов (пример эксперимент 1), подготовить 350 мкл биотинилированного лектинов, что достаточно для всех подрешеток.
- В одном гликана эпитоп / биомаркеров скрининга в несколько образцов с помощью нескольких лектинов, готовить по 10 мкл каждого биотинилированного лектинов, что достаточно для одного подмассива.
- Применить 6 мкл разбавленного биотинилированного лектин (ы) для каждого подмассива слайд, и инкубировать в увлажненном окно слайд с мокрыми полотенцами бумаги при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промойте слайды с PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый тименя.
- Высушите слайд вращая его в 1200 мкг в центрифуге в течение 2 минут.
7. Применение краски Маркированный NeutrAvidin для обнаружения флуоресценции
- Подготовить 350 мкл Dylight 549 помечены NeutrAvidin, что достаточно для всех подрешеток.
- Применить 6 мкл Dylight 549 помечены NeutrAvidin на каждый подмассива, и инкубировать слайд в увлажненном кассету слайдов при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промойте слайд с PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый раз.
- Высушите слайд вращая его в 1200 мкг в центрифуге в течение 2 минут.
8. Получить Microarray слайдов изображения путем сканирования слайдов
- Сканирование слайдов с помощью флуоресценции сканер микрочипов на 10 мкм разрешением. Лазера и PMT настройки должны быть как можно более прочными, но не насыщение месте не наблюдается.
9. Извлечение данных и анализа
- Откройте изображение в ArrayPro 3.2. Настройка шаблона массива по массиву карта, которая показывает антитела пятна местах. Тщательно выровняйте каждый шаблон круга на соответствующем месте в изображении.
- Извлечение интенсивность каждого места в Excel файл для последующего анализа.
10. Представитель Результаты
Пример эксперимента 1
Гликозилирование профилирования несколько сыворотки гликопротеинов в гепатоцеллюлярной карциномы сыворотки образец с помощью химически заблокировали антител микрочипов с несколькими обнаружения лектинов.
Целью данного эксперимента является изучение индивидуального профиля гликозилирования 20 гликопротеинов в гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) сыворотки образец с помощью химически заблокировали антител микрочипов с лектин обнаружения. Антитела микрочипов, что содержит 48 идентичных подмассивы которые включают 26 антител и биотин-BSA, был разработан и изготовлен, как описано в SТЭП 1. Эти 26 антитела против 20 гликопротеинов сыворотки, которые определены как перспективные ранней диагностики значение для больных ГЦК с помощью лектинов на основе иммунопреципитации в сочетании с масс-спектрометрического идентификации белков 12, 32, как показано в таблице 1. Структура и расположение пятен антител печатается в трех экземплярах, по одному представителю подмассива показаны на рисунке 1E и 1F, соответственно. Два одинаковых слайды микрочипов, один не был химически заблокировали (рис. 1а), а другой был (рис. 1б), были использованы для выполнения такой же эксперимент профилирования гликозилирования для того, чтобы продемонстрировать важность химически блокирования процедуры анализа. Для химически заблокировали слайд (рис. 1б), эксперимент начался в шаге 2, ибо ни химически заблокировали слайд (рис. 1а), эксперимент начался с Шаг 3. Эксперимент проводился на followinг все шаги, описанные в протоколе, за исключением шага 5.1.2 и 6.1.2. В шаге 5.2, PBST0.1 контрольного образца был применен на подмассивы в графе 1 и 3, объединенных ГЦК сыворотки была применена на подмассивы в колонке 2 и 4, соответственно (как показано на рисунке 1G). Это сравнение, чтобы показать эффективность, эффективность процедуры, а также антигены сродство антител после химической блокировки. 22 биотинилированного лектинов (как показано в Таблице 1), характерных для различных гликанов 18, 20 были применены на каждом подмассива как показано на рисунке 1G для гликозилирования профилирования. Изображения химически заблокировали (рис. 1б) и не химически заблокировали (рис. 1А) микрочипы после анализа гликозилирования профилирования, следуя протоколу. Как показано в подмассивы в графе 1 и 3, не связанных с химически заблокировали микрочипов (рис. 1А и рисунок 1С), на которомтолько PBST0.1 была применена, большинство лектинов обязаны захватить антител, и показали очень высокий фон, сопоставимых с подмассивы в колонке 2 и 4, на котором сыворотки был применен. Невозможно получить информацию гликана профиль из этого слайда микрочипов. Напротив, когда тот же эксперимент был проведен на химически заблокировали слайд микрочипов антитела, подмассивы в графе 1 и 3, на котором только PBST0.1 была применена, большинство лектинов не показали или очень низкой привязки захвата антител, в то время как высокая антиген привязки по-прежнему наблюдается в подмассивы в колонке 2 и 4, на котором сыворотки был применен (рис. 1B и 1D). Это результат показал химически блокирование процедура была важным шагом Поэтому измерение гликанов на антитела захватили гликопротеинов. Следуя протоколу, гликозилирование профилей из 22 гликопротеинов в сыворотке ГЦК может быть получено.
Эксперимент 2
Экран для измененного fucosylation по конкретным сыворотки гликопротеины в качестве биомаркеров для дискриминации цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы пациентов.
Цель этого эксперимента для выявления измененных fucosylation по конкретным сыворотки гликопротеины в качестве биомаркеров, являющиеся дискриминационными по цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) пациентов. В отличие от эксперимента 1, в котором только один образец сыворотки был применен на каждый подмассивы и исследовал различные лектинов, в этом тесте, всего 40 различных образцов сыворотки с ГЦК и циррозом печени пациента наносится на каждый подмассива и исследовали с одной лектин (AAL ). Статистический анализ, такие как T тест, приемник-характеристической (ROC) кривой, это было сделано для оценки распределения или диагностических производительность гликана epiptope / биомаркеров на каждого белка во всех образцах сыворотки. Мы использовали тот же микрочипов антитела производятся в эксперименте 1, за исключением анти-CA19-9 и анти-Льюис Х антитела в этом исследовании. Экспериментаiment проводилась с сентября 2 Шаг 9, за исключением шага 5.1.1 и 6.1.1. Всего 40 образцов сыворотки от 20 циррозом печени и 20 больных ГЦК были применены наугад подмассива 48 подмассивы вместе с контрольными образцами PBS в качестве отрицательного контроля. Fucosylation каждого захваченного белков, то обнаруживается с помощью биотинилированного фукозы конкретных лектинов. Микрочипов изображение, показанное на рисунке 1 продемонстрирована лектин AAL только связывается с белками сыворотки, захваченные на микрочипов (рис. 2D), а захваченных антител (рис. 2Е). AAL обязательным интенсивности все места были затем экстрагировали и анализировали с помощью теста T и ROC кривые оценки эффективности fucosylation (AAL обязательным интенсивности) каждого из сывороточного белка на дискриминацию между ГЦК и циррозом групп. Результаты показали, что fucosylation из белка GP73 дал лучший различия между двумя группами р = 0,03 и площадь под-Кривая ROC кривой равна 0,72. Данный эксперимент показал, эта процедура является быстрым, эффективным методом гликана эпитоп / биомаркеров скрининг на нескольких образцов в течение нескольких белков.
| ID | Название реагента | Сокращение | Компания | Каталог # |
| L1 | Биотинилированные конканавалин | ConA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L2 | Биотинилированные Бузина черная лектина | СНС | Vector Laboratories | B-1305 |
| L3 | Биотинилированные объектива Culinaris агглютинин | ДМС | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L4 | Биотинилированный Ricinus Communis агглютинин я | RCA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L5 | Биотинилированные алейрий Aurantia лектина | AAL | Vector Laboratories | B-1395 |
| L6 | Биотинилированные Erythrina Cristagalli лектина | ECL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L7 | Биотинилированные Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia лектина II | GSL II | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L8 | Биотинилированные зародышей пшеницы агглютинин | WGA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L9 | Биотинилированные Phaseolus Erythroagglutinin вульгарные | PHA-E | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L10 | Биотинилированные Phaseolus Leucoagglutinin вульгарные | PHA-L | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L11 | Biotinylated агглютинин арахиса | ПНА | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L12 | Биотинилированный Pisum Sativum агглютинин | PSA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L13 | Биотинилированные Dolichos Biflorus агглютинин | Администратор базы данных | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L14 | Биотинилированные лектина дурмана Datura | DSL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L15 | Биотинилированные софоры Japonica агглютинин | SJA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L16 | Биотинилированные агглютинин сои | SBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L17 | Биотинилированные Solanum Tuberosum (картофеля) лектина | STL | Vector Laboratories | BK-3000 </ TD> |
| L18 | Биотинилированные Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia лектина я | GSL Я | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L19 | Биотинилированные Vicia Villosa лектина | VVL | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L20 | Биотинилированные Lycopersicon ESCULENTUM (томат) лектина | НПВ | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L21 | Биотинилированные Ulex Europaeus агглютинин я | UEA я | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L22 | Биотинилированные джакалин | Джакалин | Vector Laboratories | BK-3000 |
| A1 | Коза F (аb ') 2 фрагментов анти-человеческий IgM, антител Fc5μ | IgM | Джексон Иммуно исследований | 109-006-129 |
| A2 | Осел F (аb ') 2Frag анти-человеческий IgG (H + L) антител | AB1 | Джексон Иммуно исследований | 709-006-149 |
| A3 | Мышь анти-человеческий IgG F (аb ') 2 моноклональных антител | AB3 | Джексон Иммуно исследований | 209-005-097 |
| A4 | Коза анти-человеческий альфа-2-макроглобулина поликлональных антител | A2M | GeneTex | GTX62924 |
| A5 | Кролик против человеческого альфа-1-антитрипсина поликлональных антител | A1AT | Ли Biosiences | CA1T-80А |
| A6 | Мышь анти-человеческий альфа-1-антитрипсина моноклональных антител | A1AT | Sigma Aldrich | SAB4200198 |
| A7 | Кролик против человеческого альфа-1-антитрипсина поликлональных антител | ДЕЙСТВОВАТЬ | NeoMarkers | РБ-367-A1 |
| A8 | Кролик против человеческого альфа-1-античныйhymotrypsin поликлональных антител | ДЕЙСТВОВАТЬ | Fisher Scientific | RB9213R7 |
| A9 | Мышь против человеческого трансферрина моноклональных антител | Трансферрина | GeneTex | GTX101035 |
| A10 | Кролик против человеческого трансферрина поликлональных антител | Трансферрина | GeneTex | GTX77130 |
| A11 | Коза против человека аполипопротеина J поликлональных антител | ApoJ | Abcam | ab7610 |
| A12 | Мышь против человека GP73 моноклональных антител | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
| A13 | Мышь против человека GP73 моноклональных антител | GP73 | Santa Cruz Biotechnology INC | SC-101 275 |
| A14 | Кролик против человеческого альфа-1-фетопротеин поликлональных антител | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
| A15 | Мышь анти-человеческий альфа-1-фетопротеин моноклональных антител | AFP | Фитцджеральд | 10-A05A |
| A16 | Мышь против человека hemopexin моноклональных антител | Hemopexin | Assaypro | 60190-05011 |
| A17 | Мышь против человека glypican-3 (1G12), моноклональные антитела | GPL3 | Санта-Крус-Био | SC-65443 |
| A18 | Мышь против человека кининогена (ЛМЗ), моноклональные антитела | Кининогена | Assaypro | 20333-05011 |
| A19 | Кролик против человека MMP-21 моноклональных антител | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
| A20 | Мышь против человека CEACAM-1 моноклональные антитела | CEACAM | R & D Systems | MAB1180 |
| 21 | Крысы против человека DPPIV/CD26 моноклональных антител | DPPIV | R & D Systems | MAB22441 |
| A22 | Мышь против человека пивка II моноклональных антител | PIVICA | Кристалл химических | 8040 |
| A23 | Мышь против раково-эмбрионального антигена | CEA | США биологические | C1300 |
| A24 | Мышь анти-CA125 антиген рака | CA125 | США биологические | C0050-01D |
| A25 | Мышь анти-CA19-9 рака антиген | CA19-9 | США биологические | C0075-18 |
| A26 | Мышь против Льюиса х моноклональных антител | Льюис X | Calbiochem | 434631 |
| био | Биотинилированные BSA (положительный контроль) | Bio | Самодельный | N / A |
Таблица 1. Список лектинов и антител, используемые в настоящем протоколе.
| Название / реагент с оборудованием | Компания | Номер по каталогу |
| Non microarrayer контакт | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
| 384 микропланшет | Рыбак | 14-230-243 |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
| Ультратонкие нитроцеллюлозы coate микрочипов скользит | Gentel | PATH |
| Слайд Импринтер (опционально) | Гель компании | WSP60-1 |
| Шейкер | Рыбак | 15-453-211 |
| Центрифугировать | Эппендорф | 5804 000.013 |
| Вставьте умывальника / Авто окрашивания блюд шм Съемная стойка | Рыбак | 08-812 |
| Слайд инкубации камеры / предметное стекло окна | Рыбак | 03-448-5 |
| Бридж 35, 30 / о% раствора в воде | Acros Organics | AC32958-0025 |
| Твин-20 | Рыбак | P337-100 |
| Периодатом натрия (NAIO 4) | Сигма | 311448 |
| L-глутаминовая кислота γ-гидразида | Сигма | G-7257 |
| Ацетат натрия безводный (CH 3 COONa) | Сигма | S2889 |
| Бычьего сывороточного альбумина (БСА) | Lampire биологической лаборатории | 7500804 |
| Фосфатного буфера солевым раствором (PBS) (10X) | Denville Научные | CP4390-48 |
| Dylight 549 сопряженных NeutrAvidin | Thermo | 22837 |
| Таблетки ингибитор протеазы коктейль | Roche | 4693159001 |
| ChromPure человека IgG, Fc фрагмент | Джексон Immunoresearch | 009-000-008 |
| ChromPure человека IgG, все молекулы | Джексон Immunoresearch | 009-000-003 |
| ChromPure мышь IgG, все молекулы | Джексон Immunoresearch | 015-000-003 |
| ChromPure мышь IgG, Fc фрагмент | Джексон Immunoresearch | 015-000-008 |
| ChromPure кролика IgG, все молекулы | Джексон Immunoresearch | 011-000-003 |
| ChromPure Donkey IgG, все молекулы | Джексон Immunoresearch | 017-000-003 |
| Microarray сканер | Tecan | Л.С.: Перезагрузка |
Таблица 2. Списокоборудования и реагентов, используемых в этом протоколе.
Схема 1 Схема показывает лектин микрочипов антител основан гликана биомаркеров открытие процесса 1 (шаг 2 до 4): Блок антител микрочипов с блокаторами (Glu-гидразид) и BSA, 2 (Шаг 5):.. Применять сыворотки крови и захвата конкретные гликопротеинов со специфическими антителами, 3 (Шаг 6): применяется биотинилированного лектин (ы), 4 (Шаг 7): Probe биотинилированного AAL с Dylight 549 помечены NeutrAvidin для микрочипов изображений.
Рисунок 1. Microarray изображения образца Эксперимент 1 гликозилирования профилирования несколько сыворотки гликопротеинов в ГЦК сыворотки образец с помощью химикосоюзника заблокирован антител микрочипов с несколькими лектин обнаружения. Два одинаковых слайды микрочипов, (А) ни химически заблокирован, или (б) химически заблокировали, как описано в шаге 2, и прошел через все шаги от 2 до 9 для гликозилирования профилирования, а также сравнение цели. (А) и (Б) микрочипов изображений, отсканированных на шаге 8 разрешением 10 микрон. (C) увеличить изображение первых двух строк ни химически заблокировали микрочипов слайдов (A), (D) увеличить изображение первых двух строк, не химически заблокировали микрочипов слайдов (B)), (E) Схема расположения антител в каждой подрешетки, (F) множество карт: расположение каждого антитела в подмассива, каждое антитело имя представляет собой 3 места; (G), сыворотки и лектин местоположение: Диаграмма показывает, какие подмассива каждого образца сыворотки и лектин был применен на.
Рисунок 2. Microarray изображенийпример эксперимент 2 экрана измененное fucosylation по конкретным сыворотки гликопротеины в качестве биомаркеров, являющиеся дискриминационными по цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы пациентов. Анализ микрочипов проводились, как описано в примере Эксперимент 2 раздела. (А) все изображение слайд микрочипов слайд с шага 8, (б) схема расположения антител в каждой подрешетки (C) массив карт: расположение каждого антитела в подмассива, каждое антитело имя представляет 3 места; (D) зум-в образе подмассива, которые инкубировали с сывороткой образца, (E) зум-в образе подмассива, что инкубируют с PBS контроля.
Рисунок 3. Гликан профилирования результаты эксперимента образец 1. Каждая гистограмма представляют собой лектин обязательным профилем (или гликана профилей) одного из 20 проверенных белка. Всего 22 различных лектинов были использованы для анализа йэлектронной гликана профиль каждого белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Белка-мишени и выбор захвата антител
До анализа микрочипов антитела, некоторые реактивы и материалы, необходимые для рассмотрения и подготовки. Для разработки антител микрочипов для гликана профилирования или гликана биомаркеров скрининга, панель антител, специфичных к гликопротеин кандидаты должны определяться в соответствии с литературой или с предыдущими результатами. Эти антитела, как правило, приобретенных у различных производителей, таких как R & D Systems и т.д. IgGs предпочитают захват антитела, так как наши предыдущие тесты показали, что некоторые IgM и IgE может полностью потерять свои антиген сродства после химической модификации.
2. Разработка и производство антител микрочипов
Производство микрочипов антител является дополнительным шагом, который нуждается в профессиональной и дорогой microarrayer и хорошо обученный персонал для работы. Тем не менее, индивидуальные антитела микрочипов производителейтуры можно легко сделать из услуг, таких как Serome Biosciences Инк Для надежного результата, мы рекомендуем бесконтактного microarrayer, такие как Scienion sciFLEXARRAYER ультра низкого объема бесконтактного microarrayer который был использован в нашем производстве микрочипов антител. Высокая способность к связыванию микрочипов горки, такие как PATH (Gentel Bio Инк WI) или слайдов H (Шотт, П.А.).
3. Выбор и подготовка Гликан белков (ГБ) для гликозилирования профилирования
ГБ, предназначенных для различных моно-или олигосахаридов, можно найти в литературе, и через поисковую систему разработанных Хааб лаборатории 29 и поддерживается на Поступательное Genomics института Чтобы выбрать ГБ с высокой специфичностью и сродством кцелевых эпитопов гликана выберите мотив (эпитопов) из выпадающего меню, и нажмите кнопку "поиск". ГБ, специфичных для данного мотива (эпитопов) будут перечислены в соответствии с их значением LOgp от высокого до низкого порядка. Высшее LOgp указывает на сильное сродство и специфичность к мотиву гликана / эпитоп. Из-за присущего неспецифического связывания вопрос с лектин, этот метод еще не так, как оптимальный антител на основе анализа. Таким образом, мы настоятельно рекомендуем, чтобы анти-гликана антитела используются, такие как анти-Льюис х или анти-сиалил Льюис антитела, если они имеются. Использование нескольких ГБ для обнаружения другой стратегии перепроверить различных профилей и обязательным для получения достоверной привязки данных.
4. Анализ данных
Поскольку этот метод используется для определения родного сывороточных белков, белок-белковые комплексы могут быть захвачены и обнаружено. Вестерн-блот или масс-спектрометрии хорошо методов для проверки данных микрочипов. В то же время, Обнаружение белка с использованием тех же микрочипов еще один способ узнать подробности гликозилирования изменение белка, например, являются ли изменения были связаны с изменением уровня общего белка, или просто, что гликозилирование уровня увеличился на каждого из белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Институтом гепатитов и вирусных исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated Concanavalin A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
| Biotinylated Sambucus Nigra Lectin | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
| Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
| Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA |
| Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
| Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
| Biotinylated Wheat Germ Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
| Biotinylated Peanut Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
| Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA |
| Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
| Biotinylated Datura Stramonium Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
| Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
| Biotinylated Soybean Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
| Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
| Biotinylated Vicia Villosa Lectin | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
| Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
| Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
| Biotinylated Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 | JACALIN |
| Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
| Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
| Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
| Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody | GeneTex | GTX62924 | A2M |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | Lee Biosiences | CA1T-80A | A1AT |
| Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | NeoMarkers | RB-367-A1 | ACT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
| Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody | GeneTex | GTX101035 | Transferrin |
| Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody | GeneTex | GTX77130 | Transferrin |
| Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody | Abcam | ab7610 | ApoJ |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
| Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
| Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
| Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody | Assaypro | 60190-05011 | Hemopexin |
| Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
| Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
| Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
| Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
| Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
| Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody | Crystal chem | 8040 | PIVICA |
| Mouse anti-carcin–mbryonic antigen | US biological | C1300 | CEA |
| Mouse anti-CA125 Cancer Antigen | US biological | C0050-01D | CA125 |
| Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen | US biological | C0075-18 | CA19-9 |
| Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
| Biotinylated BSA (positive control) | Home-made | N/A | Bio |
| Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol. | |||
| Non contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
| 384 microplate | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
| Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides | Gentel | PATH | |
| Slide Imprinter (optional) | The Gel Company | WSP60-1 | |
| Shaker | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 000.013 | |
| Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Slide incubation chamber/microscope slide box | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
| Brij 35, 30 w/v% solution in water | Acros Organics | AC32958-0025 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
| Sodium Periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
| L-Glutamic acid γ-hydrazide | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
| Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
| Dylight 549 conjugated NeutrAvidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Group | 4693159001 | |
| ChromPure Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
| ChromPure Donkey IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
| Microarray Scanner | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
| Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol. | |||
References
- Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
- Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
- Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
- Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
- Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
- Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
- Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
- Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
- Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
- Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
- Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
- Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
- Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
- Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
- Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
- Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
- Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
- Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
- Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
- Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
- Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
- Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
- Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
- Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
- Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
- Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
- Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
- Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
- Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
- Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
- Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
