Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

doi: 10.3791/3791 Published: May 4, 2012

Summary

En este estudio, se describe un protocolo mejorado para una micromatriz anticuerpo multiplexado de alto rendimiento con el método de detección de lectina que se puede utilizar en perfiles de glicosilación de proteínas específicas. Este protocolo incluye nuevos reactivos fiables y reduce significativamente el tiempo, el coste y los requisitos de equipos de laboratorio, en comparación con el procedimiento anterior.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Imprimir un microarray de anticuerpos para el ensayo

  1. Diluir todos los anticuerpos a 0,5 mg / ml en solución salina de tampón fosfato, pH 7,2 (PBS).
  2. Alícuota de 40 l de cada anticuerpo en la placa de la fuente de 384 pocillos.
  3. Coloque la placa de fuente de 384-y en el microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
  4. Carga de 20 diapositivas de microarrays de PATH en el microarrayer como blanco.
  5. Ajuste el microarrayer para imprimir 48 subarreglos idénticos, en el que 27 anticuerpos y las proteínas de control detectadas por triplicado en un patrón de 9x9 (Figura 1E, 1F).
  6. Inicie el microarrayer para imprimir las diapositivas de microarrays de anticuerpos.
  7. Recoge las diapositivas de microarrays de anticuerpos, y almacenarlos en cassette de diapositivas con desecante. Pase la aspiradora sellar el cartucho en una bolsa de plástico mediante el uso de sellador al vacío (FoodSaver).
  8. Almacenar las diapositivas microarray cerrados a 4 ° C en el refrigerador.

2. Químicamente Bloquear el microarray de anticuerpos para prevenir EURLa unión a los anticuerpos de captura

El ensayo de microarrays se inicia una vez que las diapositivas de microarrays son químicamente bloqueado y tiene una duración de unas 8 horas. Una vez iniciado el ensayo de microarrays ha de ser completado (los pasos 2 a 8).

  1. Tome los microarrays se desliza fuera de la nevera, y equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  2. Retire la corredera de la caja de almacenamiento y brevemente enjuague con tampón fosfato salino pH 7,2 con Tween 20 al 0,1% (PBST0.1) una vez en una diapositiva de lavabo, y luego en 15 mM de sodio pH 5,0 con tampón de acetato de 0,1% de Tween (CBT0 0.1) de una manera secuencial. Incubar los portaobjetos en CBT0.1 durante 10 minutos en la cuenca de diapositivas de lavado.
  3. Preparar fresca 150 mM NaIO4 en 15 mM de tampón acetato de sodio pH 5,0 (CB), y guárdelo en en una diapositiva de lavabo en un refrigerador, evitando la luz antes de su uso.
  4. Retire el portaobjetos de la CB, y lo puso en la cuenca que contiene frescos NaIO4 con la cara de anticuerposhacia arriba. Cubra el recipiente con papel de aluminio para evitar la luz, y se incuba la cuenca de diapositivas durante 2 horas con agitación suave a 4 ° C en un refrigerador.
  5. Preparar 300 ml de 10 mM de ácido glutámico hidrazida (el bloqueador) en el CB.
  6. Retire la corredera de la cuenca, y enjuagarlo brevemente en el CB 3 veces durante 5 minutos cada vez, en la cuenca de diapositivas de lavado.
  7. Incubar las diapositivas en el bloqueador en una pileta de lavar durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave.
  8. Retire las diapositivas de la cuenca, y los lavarás con PBST0.1 durante 3 minutos.

3. Bloquear no específicas de enlaces para la Microarray con albúmina sérica bovina (BSA)

  1. Preparar 300 ml de BSA al 1% en tampón fosfato pH 7,2 con solución salina al 0,5% de Tween (PBST0.5) en una cuenca de diapositivas de lavado, y se incuba la diapositiva microarrays en la cuenca durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.
  2. Enjuague los portaobjetos en PBST0.1 tres veces durante 3 minutos cada vez.
  3. Coloque la diapositivaen un estante de la diapositiva, y giran a 1.200 xg en una centrifugación durante 2 minutos para secar la diapositiva de microarrays.

4. Pie de imprenta Red de Cera en la diapositiva de microarrays para separar cada submatriz

  1. Pre-calentar el impresor de cera a 70 ° C durante 5 minutos.
  2. Cargue el microarreglo bloqueado en el impresor de cera con la cara de anticuerpos frente a la cera. Retire con cuidado el mango a la cera de sello en la diapositiva de manera uniforme.

5. Aplicar las muestras de suero en el microarreglo

  1. Durante el Paso 2.4, preparar las muestras de suero para el ensayo de cualquiera de los perfiles glico en una muestra (5.1.1), o la única medición de glico epiptope entre las múltiples muestras (5.1.2).
    1. En un experimento para los profilings glicanos de glicoproteínas séricas múltiples en una sola muestra de suero mediante el uso de múltiples Gbps (véase el experimento muestra 1), muestras de suero se aplica en todos los subcampos. En este caso, 40 l de suero amplio se diluye en 360 l de PBS que contenía 0,1%Tween-20, 0,1% de Brij 35, 100 ug / ml de IgG de ratón, 100 ug / ml de IgG de rata, 100 ug / ml de IgG de conejo, 100 ug / ml de IgG de cabra y 100 ug / ml de IgG de burro. Este volumen es suficiente para la aplicación de 6 l de solución de suero diluido en cada submatriz.
    2. En un experimento para la medición de un glicano en varias proteínas del suero entre múltiples muestras de suero mediante el uso de una detecciones GBP (véase el experimento muestra 2). En este caso, 1 l de suero amplio se diluye en 9 l de PBS que contenía 0,1% de Tween-20, 0,1% de Brij 35, 100 ug / ml de IgG de ratón, 100 ug / ml de IgG de rata, 100 ug / ml de IgG de conejo , 100 mg / ml de IgG de cabra y 100 ug / ml de IgG de burro. Este volumen es suficiente para la aplicación de 6 l de solución de suero diluido en cada submatriz.
  2. Después de sello de cera en el paso 4, aplique cuidadosamente 6 ml de muestra diluida o de muestras de control (PBST0.1) a cada submatriz de la diapositiva. Incubar el portaobjetos en un casete humidificado con toallas de papel mojadas a temperatura ambientedurante 1 hora.
  3. Enjuague el portaobjetos con PBST0.1 tres veces durante 3 minutos cada vez.
  4. Secar el portaobjetos haciéndolo girar a 1200 xg durante 2 minutos.

6. Aplicar biotinilado EUR (anticuerpo de lectina o Anti-glucano) en la diapositiva

  1. Durante el Paso 2.4, preparar 10μg/ml de las lectinas con biotina o Gbps en PBST0.1.
    1. En el experimento de perfiles de glicano que la sonda una muestra con las lectinas múltiples (experimento muestra 1), preparar 350 l de la lectina biotinilada que es suficiente para todas las submatrices.
    2. En un solo epítopo glicano / biomarcadores de detección en muestras múltiples mediante el uso de lectinas múltiples, preparar 10 l de cada lectina biotinilada que es suficiente para una submatriz.
  2. Aplicar 6 l de la lectina diluida con biotina (s) a cada submatriz de la corredera, y se incuba en el cuadro de diapositivas humidificado con toallas de papel húmedo a temperatura ambiente durante 1 hora.
  3. Enjuague los portaobjetos con PBST0.1 tres veces durante 3 minutos cada uno timí.
  4. Secar el portaobjetos haciéndolo girar a 1200 xg en centrifugar durante 2 minutos.

7. Aplicar neutravidin Dye etiquetados para la detección de fluorescencia

  1. Preparar 350 l de 549 DyLight neutravidin etiqueta que es suficiente para todas las submatrices.
  2. Aplicar 6 l de DyLight 549 neutravidin etiquetado en cada submatriz, e incubar el portaobjetos en el cassette deslizante humidificado a temperatura ambiente durante 1 hora.
  3. Enjuague el portaobjetos con PBST0.1 tres veces durante 3 minutos cada vez.
  4. Seque la diapositiva haciendo girar la que en 1200 xg en centrifugar durante 2 minutos.

8. Obtener imágenes de microarrays de diapositivas mediante el análisis del Slide

  1. Busque en la diapositiva mediante el uso de un escáner de fluorescencia de microarrays con una resolución de m 10. Los parámetros del láser y PMT debe ser tan fuerte como sea posible, pero no hay punto de saturación se observa.

9. Extracción de datos y análisis

  1. Abra la imagen en ArrayPro 3.2. Configurar la plantilla de conjunto de acuerdo con el mapa de matriz que muestra los puntos de anticuerpos lugares. Alinear cuidadosamente cada círculo plantilla sobre el punto correspondiente de la imagen.
  2. Extraer la intensidad de cada punto en un archivo de Excel para su posterior análisis.

10. Los resultados representativos

Ejemplo Experimento 1

Glicosilación perfiles de múltiples glicoproteínas de suero en la muestra del paciente carcinoma hepatocelular suero mediante el uso de microarrays químicamente bloqueado anticuerpo con detección de lectinas múltiple.

El objetivo de este experimento es estudiar el perfil de glicosilación individual de 20 glicoproteínas en el carcinoma hepatocelular (CHC) de la muestra el suero del paciente mediante el uso de microarrays de anticuerpos bloquean químicamente con la detección de lectina. Un microarray de anticuerpos, que contiene 48 subarreglos idénticos que incluyen 26 anticuerpos y biotina BSA-, fue diseñado y fabricado como se describe en Step 1. Estos anticuerpos fueron 26 contra 20 glicoproteínas de suero que identificados como prometedores valor diagnóstico precoz de pacientes con HCC mediante inmunoprecipitación lectina base combinado con la identificación de proteínas de espectrometría de masa 12, 32 como se muestra en la Tabla 1. El patrón y la disposición de las manchas de anticuerpos impresos por triplicado en un representante submatriz se muestra en la Figura 1E y 1F, respectivamente. Dos diapositivas microarrays idénticos, uno no era químicamente bloqueado (Figura 1A), mientras que la otra fue (Figura 1B), se utilizaron para llevar a cabo el experimento glicosilación perfilado mismo con el fin de demostrar la importancia del procedimiento de bloqueo químico para el análisis. Para la diapositiva químicamente bloqueado (Figura 1B), el experimento se inició en el Paso 2, por la diapositiva ninguno químicamente bloqueado (Figura 1A), el experimento se inició a partir del paso 3. El experimento fue llevado por following todos los pasos descritos en el protocolo, excepto para el paso 5.1.2 y 6.1.2. En el Paso 5,2, una muestra de control PBST0.1 se aplicó sobre subarreglos en la columna 1 y 3, y una muestra de suero agrupado CHC se aplicó sobre subarreglos en la columna 2 y 4, respectivamente (como se muestra en la Figura 1G). Esta comparación es mostrar la eficacia, la eficiencia del procedimiento, así como la afinidad de unión al antígeno de los anticuerpos después de bloqueo químico. 22 lectinas biotiniladas (como se muestra en la Tabla 1) que específico para glicanos diferentes 18, 20 se aplicaron a cada submatriz como se muestra en la Figura 1G para perfiles de glicosilación. Las imágenes de las químicamente bloqueados (Figura 1B) y bloqueado no químicamente (Figura 1A) micromatrices después del ensayo de perfiles de glicosilación, siguiendo el protocolo. Como se muestra en las submatrices de la columna 1 y 3 de no-químicamente bloqueados microarrays (Figura 1A y 1C Figura), en las quesólo PBST0.1 se aplicó, la mayoría de las lectinas obligado a capturar anticuerpos, y mostró fondo muy alto que comparables a aquellas subarreglos en la columna 2 y 4, en las que se aplicó la muestra de suero. Es imposible obtener información sobre el perfil de este glicano microarrays de diapositivas. Por el contrario, cuando el mismo experimento se realizó sobre un portaobjetos de anticuerpos microarrays químicamente bloqueado, los subarreglos en la columna 1 y 3, en la que sólo se aplicó PBST0.1, la mayoría de las lectinas mostró enlaces no o muy baja para capturar anticuerpos, mientras que el antígeno de alta fijaciones se observaron todavía en subarreglos en la columna 2 y 4, en la que muestra de suero se aplicó (Figura 1B y 1D). Estos resultados mostraron el procedimiento de bloqueo químico era un paso fundamental tanto la medición de los glicanos en las glicoproteínas de anticuerpos capturados. Siguiendo el protocolo, los perfiles de glicosilación de 22 glicoproteínas en HCC suero se puede obtener.

Experimento 2

Pantalla de fucos alteradosylation sobre determinadas glicoproteínas de suero como biomarcadores para la cirrosis hepática y la discriminación pacientes con carcinoma hepatocelular.

El objetivo de este experimento es para la detección de alteraciones en determinadas fucosilación glicoproteínas de suero como biomarcadores que discriminan a la cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (CHC) de los pacientes. A diferencia del Experimento 1, en la que sólo se aplicó una muestra de suero en cada subarreglos y probaron con diferentes lectinas, en este ensayo, el total de 40 muestras diferentes de suero de HCC y cirrosis pacientes se aplica sobre cada submatriz, y probaron con una lectina (AAL ). El análisis estadístico, como la prueba T, receptor de funcionamiento característico (ROC), se llevó a cabo para evaluar la distribución o el rendimiento diagnóstico de la epiptope glicano / biomarcadores de proteína en cada persona en todas las muestras de suero. Se utilizó el mismo anticuerpo microarrays fabricados en el Experimento 1, excepto para el anti-CA19-9 y anti-anticuerpos de Lewis X en este estudio. La expeperimento se llevó a cabo a partir de 02 de septiembre con el paso 9, excepto para el paso 5.1.1 y 6.1.1. Total de 40 muestras de suero de 20 cirrosis y 20 pacientes con HCC se aplicaron a submatriz aleatoria de los 48 subarreglos junto con las muestras de control de PBS como control negativo. Fucosilación de cada una de las proteínas de los capturados fue detectado mediante el uso de biotina Fucosa específico lectina. La imagen de microarrays muestra en la Figura 1 demuestra la AAL lectina sólo a las proteínas séricas capturados en el microarray (Figura 2D) en lugar de anticuerpos capturados (Figura 2E). Las intensidades de la AAL de unión de todos los puntos fueron extraídos y analizados mediante el uso de T de prueba y las curvas ROC para evaluar el desempeño de la fucosilación (intensidad vinculante AAL) de cada proteína de suero en la discriminación entre los grupos HCC y cirrosis. Los resultados mostraron que la fucosilación de proteína GP73 dio el mejor discriminación entre los dos grupos con una p = 0,03 y el área bajocurva de la curva ROC es igual a 0,72. Este experimento demostró este procedimiento es un método rápido, eficaz para el epítopo glicano / biomarcador cribado en muestras múltiples dentro de múltiples proteínas.

Identificación Nombre del reactivo Abreviación Empresa Catálogo #
L1 Biotinilado Concanavalina A ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Biotinilado lectina Sambucus nigra SNA Vector Laboratories B-1305
L3 Biotinilado Lens culinaris aglutinina LCA Vector Laboratories BK-2000
L4 Biotinylated aglutinina de Ricinus communis que RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Biotinilado Aleuria Aurantia lectina AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Biotinilado Erythrina crista lectina ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Biotinilada aglutinina de germen de trigo Ventajas de Windows Original Vector Laboratories BK-1000
L9 Erythroagglutinin biotinilado Phaseolus vulgaris PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Leucoaglutinina biotinilado Phaseolus vulgaris PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 Bioaglutinina de maní tinylated ANP Vector Laboratories BK-1000
L12 Biotinylated Pisum sativum aglutinina PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Biotinilado Dolichos biflorus aglutinina DBA Vector Laboratories BK-1000
L14 Datura stramonium lectina biotinilada DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Biotinilado aglutinina Sophora japónica SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Aglutinina de soja biotinilado SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Biotinilado Solanum tuberosum (papa) lectina STL Vector Laboratories BK-3000 </ Td>
L18 Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I GSL I Vector Laboratories BK-2000
L19 Biotinilado Vicia villosa lectina VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Biotinilado Lycopersicon esculentum (tomate) lectina LEL Vector Laboratories BK-3000
L21 Ulex europaeus biotinilado aglutinina I UEA I Vector Laboratories BK-1000
L22 Biotinilado jacalin Jacalin Vector Laboratories BK-3000
A1 F cabra (ab ') 2 Fragmento de IgM anti-humano, el anticuerpo Fc5μ IgM Jackson Immuno Research 109-006-129
A2 Burro F (ab ') 2Frag anti-IgG humana (H + L) de anticuerpos AB1 Jackson Immuno Research 709-006-149
A3 Ratón anti-humano IgG F (ab ') 2 anticuerpo monoclonal AB3 Jackson Immuno Research 209-005-097
A4 Cabra anti-humano alfa 2 macroglobulina anticuerpo policlonal A2M GeneTex GTX62924
A5 Conejo anti-humana de alfa-1-antitripsina anticuerpo policlonal A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 Ratón anti-humano alfa-1-antitripsina anticuerpo monoclonal A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Conejo anti-humana de alfa-1-antitripsina anticuerpo policlonal ACT NeoMarkers RB-367-A1
A8 Conejo anti-humana de alfa-1-Antichymotrypsin anticuerpo policlonal ACT Fisher Scientific RB9213R7
A9 Ratón anti-transferrina humana anticuerpo monoclonal La transferrina GeneTex GTX101035
A10 Conejo anti-transferrina humana anticuerpo policlonal La transferrina GeneTex GTX77130
A11 Cabra anti-humano apolipoproteína J anticuerpo policlonal ApoJ Abcam ab7610
A12 Ratón anti-humano GP73 anticuerpo monoclonal GP73 Abbott 14H4-23
A13 Ratón anti-humano GP73 anticuerpo monoclonal GP73 Santa Cruz de Biotecnología INC sc-101275
A14 Conejo anti-humana de alfa-1-fetoproteína anticuerpo policlonal AFP GenWay GWB-41C966
A15 Ratón anti-humano alfa-1-fetoproteína anticuerpo monoclonal AFP Fitzgerald 10-A05A
A16 Ratón anti-humano hemopexina anticuerpo monoclonal Hemopexin Assaypro 60190-05011
A17 Ratón anti-humano glipicano-3 (1G12) del anticuerpo monoclonal GPL3 Santa Cruz Bio sc-65443
A18 Ratón anti-humano Quininógeno (BPM) del anticuerpo monoclonal Quininógeno Assaypro 20333-05011
A19 Conejo anti-humano MMP-21 anticuerpo monoclonal MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Ratón anti-humano CEACAM-1 anticuerpo monoclonal CEACAM R & D Systems MAB1180
A21 Rata anti-humano DPPIV/CD26 anticuerpo monoclonal DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Ratón anti-humano PIVKA II anticuerpo monoclonal PIVICA Crystal química 8040
A23 Mouse anti-antígeno carcinoembrionario CEA EE.UU. biológica C1300
A24 Mouse anti-cáncer de antígeno CA125 CA125 EE.UU. biológica C0050-01D
A25 Mouse anti-CA19-9 del cáncer de antígeno CA19-9 EE.UU. biológica C0075-18
A26 Ratón anti-Lewis x anticuerpo monoclonal Lewis X Calbiochem 434631
bio Biotinilada BSA (control positivo) Bio Hecho en casa N / A

Tabla 1. Lista de las lectinas y anticuerpos utilizados en este protocolo.

Nombre de los equipos o el reactivo s Empresa Número de catálogo
Microarrayer sin contacto BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplaca Pescador 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrafino de nitrocelulosa Coate microarrays se desliza Gentel TRAYECTORIA
Slide Imprinter (opcional) La Compañía de gel WSP60-1
Shaker Pescador 15-453-211
Centrifugar Eppendorf 5804 000.013
Deslice lavabo / Slide tinción Dish wiº bastidor extraíble Pescador 08-812
La incubación de diapositivas de cámara / caja portaobjetos del microscopio Pescador 03-448-5
Brij 35, 30 w / v% en agua Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 al Pescador P337-100
Peryodato de sodio (NaIO 4) Sigma 311448
L-glutámico ácido γ-hidrazida Sigma G-7257
Acetato de sodio anhidro (CH3COONa) Sigma S2889
Albúmina de Suero Bovino (BSA) Lampire Biológica Labs 7500804
Tampón fosfato salino (PBS) (10 veces) Denville Científico CP4390-48
DyLight 549 neutravidin conjugado Thermo 22837
Inhibidor de la proteasa cóctel comprimidos Roche 4693159001
ChromPure IgG humana, fragmento Fc Jackson Immunoresearch 009-000-008
ChromPure IgG humana, toda la molécula Jackson Immunoresearch 009-000-003
ChromPure IgG de ratón, toda la molécula Jackson Immunoresearch 015-000-003
ChromPure IgG de ratón, fragmento Fc Jackson Immunoresearch 015-000-008
ChromPure IgG de conejo, molécula entera Jackson Immunoresearch 011-000-003
ChromPure burro IgG, molécula entera Jackson Immunoresearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan LS Reloaded

Tabla 2. Listade equipos y reactivos utilizados en este protocolo.

Esquema 1
Esquema 1 Un esquema que muestra el microarray de anticuerpos lectina basados ​​en biomarcadores glicano proceso de descubrimiento 1 (Paso 2 a 4): Bloquee el microarray de anticuerpos con el antagonista (Glu-hidrazida) y BSA, 2 (Paso 5):.. Se aplican las muestras de suero y captura glicoproteínas específicas con anticuerpos específicos, 3 (Paso 6): se aplican lectina biotinilada (s), 4 (Paso 7): Sonda de la AAL biotina con DyLight 549 neutravidin etiquetado para microarrays de imágenes.

Figura 1
Figura 1. Microarray imágenes de la creación de perfiles de glicosilación Ejemplo de experimento 1 de múltiples glicoproteínas de suero en la muestra del paciente mediante el uso de suero de HCC isquémicaaliado bloqueado microarrays de anticuerpos con la detección de lectina múltiple. Dos diapositivas de microarrays idénticos, (a) ninguna químicamente bloqueado, o (B) químicamente bloqueado como se describe en el Paso 2, ambos pasaron por todos los pasos del 2 al 9 de perfiles de glicosilación, así como para fines de comparación. (A) y (B) son las imágenes escaneadas a microarrays Paso 8 en una resolución de 10 micras. (C) el zoom a la imagen de las dos primeras filas de la ninguno químicamente bloqueado microarreglo (A), (D) el zoom a la imagen de las dos primeras filas de la no químicamente bloqueado microarreglo (B)), (E) el diagrama de la disposición de anticuerpos dentro de cada submatriz; (F) los mapas de la matriz: la ubicación de cada anticuerpo en el subarreglo, cada nombre de anticuerpos representa 3 puntos; (G) Muestra de suero y la ubicación de lectina: muestra un diagrama que subarreglo cada muestra de suero y lectina se aplicó sobre.

Figura 2
Figura 2. Microarray imágenes delEjemplo de experimento 2 pantalla para fucosilación alterada en determinados glicoproteínas de suero como biomarcadores que discriminan a la cirrosis hepática y los pacientes con CHC. El ensayo de microarrays se llevó a cabo como se describe en el Experimento 2 muestra la sección. (A) La imagen de toda la diapositiva de la diapositiva de microarrays del Paso 8, (B) el diagrama de la disposición de anticuerpos dentro de cada submatriz; (C) de la matriz: los mapas de la ubicación de cada anticuerpo en el subarreglo, cada nombre de anticuerpos representa 3 puntos; (D) un zoom a la imagen de una submatriz que se incubaron con muestra de suero, (E) un zoom a la imagen de una submatriz que fueron incubadas con PBS de control.

Figura 3
Figura 3. Resultados de un experimento de creación de perfiles glicano muestra 1. Cada gráfico de barras representa el perfil de la lectina de unión (o perfiles de glicano) de una de la proteína 20 probada. Total de 22 diferentes lectinas se utilizaron para analizar ºe glicano perfil de cada proteína.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Objetivo de proteínas y selección de anticuerpos de captura

Antes del ensayo de microarrays de anticuerpos, algunos reactivos y materiales son necesarios para ser considerado y preparado. Para diseñar un microarray de anticuerpos para el perfil de glicano o cribado glicano biomarcador, un panel de anticuerpos específicos a los candidatos la glicoproteína debe determinarse de acuerdo a la literatura o de los resultados anteriores. Estos anticuerpos fueron adquiridos por lo general de diferentes proveedores, tales como el R & D Systems, etc IgG se prefieren anticuerpos de captura ya que nuestras pruebas anteriores mostraron que algunos IgM e IgE puede perder por completo sus afinidades de unión al antígeno después de la modificación química.

2. Diseño y fabricación de microarrays de anticuerpos

Fabricación de los microarrays de anticuerpos es un paso opcional que necesita microarrayer profesional y caro, y personal bien capacitado para la operación. Sin embargo, a medida de anticuerpos microarrays fabricantetura puede ser fácilmente hecho desde un proveedor de servicios tales como Serome Biosciences Inc. Para obtener un resultado robusto, se recomienda una microarrayer sin contacto, tales como el volumen de sciFLEXARRAYER Scienion ultra bajo sin contacto microarrayer que se utilizó en nuestra fabricación de microarrays de anticuerpos. Alto grado de unión de la capacidad de microarrays de diapositivas, como el PATH (Gentel Bio Inc. WI) o H de diapositivas (Shott, PA).

3. Seleccionar y preparar glicano las proteínas de unión (Gbps) de perfiles de glicosilación

Gbps que objetivo diferente mono u oligosacáridos se pueden encontrar en la literatura y por medio de un motor de búsqueda desarrollado por el laboratorio Haab 29 y se mantiene a la traslacional Instituto de Genómica Para seleccionar Gbps con una alta especificidad y afinidadlos epítopes de glicano específicas, seleccionar el motivo (epítopo) de la lista desplegable y haga clic en "Buscar". La específica Gbps a este motivo (epítopo) se enumeran de acuerdo a su valor de log P de mayor a menor orden. Superior logP indica una mayor afinidad de unión y especificidad para el motivo de glicano / epítopo. Debido a la inherente no específica cuestión de unión de la lectina, este método todavía no es tan óptimo como el ensayo de anticuerpo basado. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que los anticuerpos anti-glicanos se utilizan, tales como anti-Lewis X o anti-sialil Lewis a los anticuerpos, si están disponibles. El uso de múltiples Gbps para la detección es otra estrategia para cotejarla con diferentes perfiles de unión y para obtener datos fiables sobre el enlace.

4. Análisis de los datos

Debido a que este método se utiliza para detectar nativas proteínas del suero, los complejos proteína-proteína pueden ser capturados y detectados. Western blot o la espectrometría de masas es un buen método para validar los datos de microarrays. En el entretanto, La detección de los niveles de proteína utilizando el mismo micromatriz es otro método para conocer los detalles de la alteración de glicosilación de la proteína, tales como si los cambios fueron debido al cambio del nivel de proteína total o simplemente que el nivel de glicosilación aumentado en cada una de las proteínas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Investigaciones sobre el Virus Hepatitis y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter