Summary
Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist zu zeigen, wie die gezielte Injektion Netzhaut führen und
Abstract
Huhn embryonalen Netzhaut ist ein ausgezeichnetes Werkzeug zur Entwicklung der Retina bei höheren Wirbeltieren zu studieren. Aufgrund der Größe und externen Entwicklung ist es vergleichsweise sehr einfach, die Küken embryonalen Netzhaut mittels rekombinanter DNA / RNA-Technologie zu manipulieren. Elektroporation von DNA / RNA-Konstrukte in der embryonalen Retina haben einen großen Vorteil, um Genregulation in retinalen Stammzellen / Vorläuferzellen während der Entwicklung der Retina zu untersuchen. Verschiedene Arten von Assays wie Reportergenassay, Gen-Überexpression, Gen niederschlagen (shRNA) etc. kann mit Hilfe der Elektroporation Technik werden. Dieses Video demonstriert gezielte Einspritz-und Retina-in-ovo-Elektroporation in die embryonale Hühnchenretina in der Hamburger und Hamilton Stadium 22-23, die etwa embryonalen Tag 4 (E4) ist. Hier zeigen wir eines schnellen und komfortablen in-ovo-Elektroporation Technik, bei der eine Plasmid-DNA, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) drückt als Marker wird direkt in die gelieferteKükenembryonen subretinalen Raum, gefolgt von elektrischen Impulsen zur DNA-Aufnahme durch Netzhaut-Stammzellen / Vorläuferzellen zu erleichtern. Die neue Methode der retinalen Injektion und Elektroporation auf E4 ermöglicht die Visualisierung der einzelnen retinalen Zelltypen, einschließlich der spätgeborene Neuronen 1, die schwierig gewesen ist mit dem herkömmlichen Verfahren der Injektion und Elektroporation bei E1.5 2.
Protocol
Da einige Teile des Protokolls durchgeführt werden als zuvor in anderen JoVE Videos 2 und 3 Papiere mit geringen Modifikationen beschrieben werden wir nicht zu diskutieren, die hier im Detail.
1. Egg Handhabung und Zubereitung Needle
- Eier können in einem Wein gelagert-Kühler werden bei etwa 13 ° C für bis zu 1 Gespräch. Wenn die Temperatur zu hoch ist, werden Embryonen anfangen, abnormal entwickeln, während niedrigere Temperatur bewirkt eine hohe Mortalität. Sobald Sie bereit sind zu bebrüten nehmen Sie die Eier aus dem Weinkühler und legen die Eier senkrecht mit dem größeren Ende auf. Halten Sie die Eier in der Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden, bevor sie sie in der 37,5 ° C Inkubator.
- Bebrüten die Eier für 96 bis 100 Stunden, die über embryonalen Tag 4 ist zu Embryonen, die in der Hamburger und Hamilton Stufe 22 sind 5.4 zu erhalten.
- Bereiten Mikropipette Nadeln aus gezogen Glaskapillarrohre und brechen Sie die Spitze unter einem Präpariermikroskop MikroUmfang mit einer Pinzette, um eine Spitze Eröffnung etwa 0,1 &mgr; m im Durchmesser und 20 mm Aufnahme zu bekommen. Nadeln mit größeren Schwierigkeiten haben, Tipps Durchstechen der Dotterhaut, während kleinere Spitzen Schwierigkeiten haben, das Be-und Bereitstellung der DNA-Lösung.
- Befestigen Sie die Nadel auf eine 0,1 ml Hamilton gasdichten Spritze auf einem Mikromanipulator montiert. Verwenden Sie ein kleines Stück Masterplex Silikonschlauch zur Befestigung der Nadel auf die Spritze. Da die Verbindungen dicht sind nicht nötig, Mineralöl hinzufügen, um diese Bindung zu versiegeln.
- Mischen Sie 2 ul-Reporter-Plasmid-DNA-Lösung mit einer Konzentration im Bereich 3-6 ug / ul und 0,2 ul schnell grün (0,025%) auf einem Stück Parafilm. Schnelle grünen Farbstoff wird helfen, die Injektion zu visualisieren. Langsam, laden Sie die Nadel mit der Mischung.
- Um die Dotterhaut von der inneren Membran frei drehen Sie das Ei vorsichtig um 180 ° und warten Sie einige Minuten und drehen Sie ihn zurück in die ursprüngliche Position und stellen Sie ihn für die Elektroporation.
- Wischen Sie die FORCeps und Eierschale mit 70% Ethanol auf eine Infektion des Embryos zu vermeiden.
- Machen Sie ein kleines Loch auf dem Ei unmittelbar über dem Luft-Zelle mit einem Paar der Größe AA Pinzette. Achten Sie darauf, die Eischale zu knacken. Entfernen Sie kleine Stücke ein zu einer Zeit um ein kleines Fenster zu machen. Entfernen Sie vorsichtig die innere Membran mit Hilfe der Pinzette ohne Berührung der Dotterhaut.
2. Injektion und Elektroporation
- Um eine Beschädigung des Gehirns oder des Herzens, die Position der Nadel kontralateralen der wichtigsten Bündel von Blutgefäßen in das Auge eintritt und weisenden Schnabel zu verhindern.
- Pierce durch die Dotterhaut, Lederhaut, Netzhaut und des Glaskörpers durch einen plötzlichen milden Druck auf die Nadel. Wenn die Nadel sticht durch das andere Ende des Auges sollte es in Ordnung sein, wenn es keine größeren Vene Blut schädigt.
- Langsam nach hinten ziehen Sie die Nadel an der Kante der Öffnung und legen Sie es fast Tangente an der Außenwand des Augapfels.
- Insert die Nadel in den Sub retinalen Raum zwischen der Lederhaut und Netzhaut.
- Spritzen Sie die DNA, bis Sie die grüne Lösung Füllen der Seite des Augapfels und Schieben der Netzhaut nach innen durch die Schaffung einer Ausbuchtung visualisieren können.
- Wenn Ihre Nadel Platzierung nicht korrekt ist dann wirst du sehen die DNA-Lösung Ausbreitung im Inneren des Glaskörpers Auffüllen der Mitte des Augapfels. Auch, wenn Sie die Netzhaut beschädigen zu viel dann werden Sie sehen die DNA-Lösung kommt aus dem Augapfel.
- Langsam entfernen Sie die Nadel und sofort platzieren die Elektroden parallel im Ei nach dem Einweichen in PBS. Drücken Sie die Elektroden zu versenken in das Fruchtwasser in einer Weise, so dass das Auge injiziert zwischen den Elektroden befindet. Berühren Sie keine größeren Blutgefäße oder das Herz mit den Elektroden beim Platzieren sie. Die negative Elektrode sollte an der Injektionsstelle Seite zu sein so dass die DNA von sub retinalen Raum in der Netzhaut in Richtung positive Elektrode transportiert werden kann. ElectroCorporate die Netzhaut mit 5 Impulsen von 15V für 50 ms mit 950 ms Intervallen.
- Entfernen Sie vorsichtig die Elektroden und dichten die Fenster des Eies mit Stücken von klaren Tesafilm.
- Label-und datieren Sie das Ei injiziert, bevor es wieder in den Inkubator. Normalerweise dauert es etwa 3 bis 5 Minuten bis die ganze Elektroporation Vorgang abzuschließen.
- GFP-Expression kann so früh wie 8 Stunden nach der Elektroporation gesehen werden. Allerdings können Sie warten, bis der Embryo auf die gewünschte Stufe vor der Ernte.
3. Repräsentative Ergebnisse
In unserer Studie verwenden wir verschiedene Plasmid-Konstrukte, um die Regulation der Genexpression, dass retinalen Zell-Entwicklung beteiligt zu studieren. In diesem Video pCAG-GFP (Transfektion Kontrolle) wurde verwendet, um eine erfolgreiche Injektion und Elektroporation folgen. Es kann jedoch jedes Plasmid Konstrukt mit Reportergen (GFP, RFP usw.) verwendet werden. Auch wenn GFP-Expression kann so früh wie 8 Stunden nach der Ele gesehen werdenctroporation wir in der Regel beginnen die Ernte das Ei am Tag 6 (E6) und weiter. Elektroporiertem Netzhäute wurden aus dem Embryo seziert und analysiert unter fluoreszierendem Dissektionsmikroskop vor Einbetten und Schneiden. Typischerweise kann die Expression des Reportergens zumindest in einem Quartal der Netzhaut nach einer erfolgreichen Elektroporation (Abb. 1) gesehen werden. Die transfizierten retinalen Gewebe wurden durch weitere Schnitte für eine klare Visualisierung von Zellmorphologien analysiert. Immunhistochemie mit Zelltyp-spezifische Marker (Brn3a, Pax6 etc.) erlaubt die Charakterisierung von Zell-spezifischen GFP-Expression (Abb. 2).
Abbildung 1. Erfolgreiche Elektroporation von Reporterplasmid Ergebnisse positiv GFP-Expression. Huhn embryonalen Netzhaut injiziert wurden und an embryonalen Tag 4 elektroporiert und geerntet an embryonalen Tag 6. Mindestens 25% der Netzhaut wurde erfolgreich transfiziert (A = Ansicht von oben, B= Ansicht von unten). Maßstab = 1 mm.
Abbildung 2. Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellen der Netzhaut mittels Immunhistochemie. GFP exprimierenden Netzhautgewebe bei E7 Bühne waren fester und geschnitten. Diese Schnitte wurden dann mit verschiedenen Zell-spezifische Marker gefärbt. Brn3a wurde verwendet, um Ganglienzellen (A) zu bestimmen, während Pax6 wurde verwendet, um horizontale, Amacrin und Ganglienzellen (B) zu bestimmen. Balken = 50 um.
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Discussion
Gezielte Injektion Netzhaut und in ovo Elektroporation in embryonale Retina bei E4 Bühne können gezielt retinalen Vorläuferzellen was in der Fähigkeit, alle sechs großen Netzhaut Zelltypen auf der Ebene einzelner Zellen sichtbar zu machen. In ovo Elektroporation bei HH10 (~ E1.5), deren Zielgruppe die Augenblase ist in der Lage, Zellen, die um das Auge bilden entwickeln transfizieren. Jedoch haben diese Zellen eine sehr hohe Fluktuation in dieser Zeit und dieses Verfahren ist nicht spezifisch für Zellen der Netzhaut. Es kann sein, dass die hohe Zellumsatzrate nachhaltig stabile Expression verhindert. Von E4, wird der Embryo genug, dass die großen Strukturen des Auges alle sind gebildet, aber jung genug, dass die Mehrheit der Zellen in der Netzhaut noch retinalen Stammzellen sind entwickelt. Diese Methode kann auch angewendet werden / Verlust der Funktion Studien, in denen ein Gen von Interesse gezielte um eine normale Entwicklung und / oder Erkrankung der Netzhaut untersucht werden können gewinnen.
Nachdem wir veröffentlichten diese Technik in unserenfrüheren Arbeit ein, kontaktierte mehrere Wissenschaftler auf diesem Gebiet uns für weitere Unterstützung an dieser Technik. Also beschlossen wir, um dieses Video für die Visualisierung zu erzeugen. Darüber hinaus werden die Fortschritte in unserem Technik, die in diesem Video beschrieben.
Um diese Technik erfolgreich durchzuführen, sind folgende kritische Faktoren beschreiben wert.
Der wichtigste Faktor ist, um die Nadel exakt platzieren in den subretinalen Raum. Erstens muss man vorsichtig sein, um die Nadel kontralateralen auf die wichtigsten Bündel von Blutgefäßen in das Auge und Schnabel weisenden auszurichten. Diese Position ist fast parallel zum Herz und verringert die Chance, das Gehirn und das Herz schädigen. Beim Durchstechen durch Dotterhaut, Lederhaut, Netzhaut und des Glaskörpers, sollte die Nadel nicht weit reisen und Pierce Blut durch jede Ader. Wenn die Nadel ist scharf genug, so kann dies sehr einfach mit wenigen Praktiken durchgeführt werden. Der nächste Schritt ist, um langsam Zurückziehen thE Nadel und platzieren Sie sie am Rand der Öffnung der Netzhaut. Es gibt immer eine Chance, ihn herauszuziehen vollständig. Wenn das passieren sollte, dann kann man wieder versuchen, die Nadelspitze zurück setzen bei der Eröffnung. Platzieren Sie die Nadel in den subretinalen Raum (zwischen Lederhaut und Netzhaut) erfordert Übung und Geduld. Am Anfang sieht es sehr schwierig, aber mit etwas Übung wird es einfach. Während Einspritzen des DNA-Lösung im Inneren des subretinalen Raum, ist es sehr wichtig, um die Ausbuchtung Bildung zu beobachten. Danach beginnt die grüne Lösung Befüllen den Umriss des Auges, was auf eine erfolgreiche Injektion. Wenn die Lösung weg diffundiert oder beginnt mit der Befüllung in die Mitte des Auges, zeigt dies eine falsche Injektion, die nicht nachgeben wird, eine erfolgreiche Elektroporation.
Der zweite Faktor ist die Herstellung eines optimalen Nadel, die über Wärme-Ziehen einer Glaskapillare und brechen Sie die Spitze hergestellt wird. Nadeln mit großen Schwierigkeiten haben, Piercing Tipps through die Dotterhaut wird das Risiko von Schäden an der Netzhaut erhöht. Normalerweise schärfsten Nadelspitzen sind am besten für diesen Zweck. Allerdings haben Nadel mit sehr kleinen Spitzen Schwierigkeit Einlegen und die DNA und haben erhöhte Chance zu brechen im Inneren des Augapfels. Aus diesem Grund machen wir Nadeln mit einer Spitze Öffnung an etwa 0,1 &mgr; m im Durchmesser und 20 mm Konus 1. Sich auch für, während des Ladens des DNA-Gemisch aus einem Tröpfchen auf einem Stück Parafilm, ist es sehr wichtig, nicht das letzte bisschen von Flüssigkeit zu laden, wie dies die Chance der fliegt durch die Luft innerhalb der Nadel erhöht.
Schließlich, rl Mit der Elektroden ist sehr entscheidend für einen erfolgreichen Elektroporation zu erreichen. Die Elektroden sollten parallel geschaltet werden, so dass die sich entwickelnden Auge zwischen den Elektroden liegt. Besondere Vorsicht sollte beim Berühren keine größeren Blutgefäße oder das Herz mit den Elektroden genommen werden. Die Beschädigung einer dieser Punkte kann zum Tod des Embryos führen, selbst nach einer erfolgreichen injectiauf. Darüber hinaus sind die beiden Augen unterschiedlich orientiert. Also, muss es im Auge behalten werden, um die Elektrode Orientierung (positiv vs negativ) so ändern, dass die negative Elektrode immer an der Injektionsstelle Seite, um die DNA diffundieren in die retinalen Zellen unter dem elektrischen Strom zu ermöglichen.
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Disclosures
Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Einrichtungen Ausschuss an der Rutgers University zugelassen.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Maaz Enver für die Nutzung seiner HD-Kamera (Cannon VIXIA HFS100) zu danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse von NIH (EY018738), New Jersey Kommission über die Spinal Cord Research (08 bis 3074-SCR-E-0 und 10-3091-SCR-E-0), und Busch Biomedical Research Award unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
