Summary

Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

Published: February 15, 2012
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Summary

Biopelículas microbianas están constituidas generalmente por distintas subpoblaciones de células especializadas. Sola célula de análisis de estas subpoblaciones requiere el uso de reporteros fluorescentes. A continuación se describe un protocolo para visualizar y controlar varias subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biopelículas utilizando microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.

Abstract

La formación de biopelículas es un atributo general a casi todas las bacterias 1-6. Cuando las bacterias forman biopelículas, las células están encerradas en una matriz extracelular que está mayoritariamente constituida por las proteínas y exopolisacáridos, entre otros 7-10. La comunidad microbiana encerrado dentro de la biopelícula a menudo muestra la diferenciación de las distintas subpoblaciones de células especializadas 11-17. Estas subpoblaciones coexisten y se muestran a menudo la organización espacial y temporal dentro del biofilm 18-21.

La formación de biopelículas en los Bacillus subtilis organismo modelo requiere la diferenciación de las distintas subpoblaciones de células especializadas. Entre ellos, la subpoblación de los productores de matriz, responsables de producir y secretar la matriz extracelular de la biopelícula es esencial para la formación de biopelículas 11,19. Por lo tanto, la diferenciación de los productores de la matriz es una característica de la formación de biopelículas en la B. subtilis.

Hemos utilizado los reporteros fluorescentes para visualizar y cuantificar la subpoblación de los productores de la matriz en las biopelículas de B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, hemos observado que la subpoblación de los productores de matriz diferencia en respuesta a la presencia de auto-producido señal extracelular surfactina 25. Curiosamente, surfactina es producida por una subpoblación de células especializadas diferentes de la subpoblación de los productores de matriz 15.

Hemos expuesto en este informe, el enfoque técnico necesario para visualizar y cuantificar la subpoblación de los productores de la matriz y los productores de surfactina en las biopelículas de B. subtilis. Para hacer esto, los reporteros fluorescentes de los genes necesarios para la producción de matriz y la producción de surfactina se insertan en el cromosoma de B. subtilis. Los reporteros se expresan únicamente en una subpoblación de células especializadas. Entonces, las subpoblaciones puede sercontrolará mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo (ver Fig. 1).

El hecho de que diferentes subpoblaciones de células especializadas coexisten dentro de las comunidades de bacterias multicelulares nos da una perspectiva diferente sobre la regulación de la expresión génica en procariotas. Este protocolo trata este fenómeno de manera experimental y puede ser fácilmente adaptado a cualquier modelo de otros tratamientos, para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la heterogeneidad fenotípica dentro de una comunidad microbiana.

Protocol

1. Etiquetado de B. subtilis y ensayo de formación de biopelículas Amplificar por PCR la región promotora del gen de interés. Se muestra como ejemplo la clonación de P tapa, el promotor de los genes responsables de la producción de TASA proteína de la matriz 26. Clon P tapa en pkm008 vector (creado por el laboratorio Rudner, Escuela Médica de Harvard. Boston, EE.UU.) (Fig. 2). Alineado de los plásmidos mediante digestión enzimáti…

Discussion

El hecho de que las comunidades bacterianas muestran las subpoblaciones de células que expresan el conjunto específico de genes evidencia la complejidad de las comunidades microbianas 33,34. Este protocolo debe ayudar a determinar si la expresión de cualquier gen de interés se limita a una subpoblación particular de células especializadas dentro de la comunidad microbiana. La visualización de estas subpoblaciones requiere el desarrollo de nuevas técnicas, porque los métodos tradicionales para control…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo está financiado por el Programa de Investigación Investigador Joven, del Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas (Zinf) de la Universidad de Würzburg. Juan C García-Betancur es un compañero de doctorado de la Escuela de Graduados en Ciencias de la Vida (GSL) de la Universidad de Würzburg.

Materials

Technique Name of the reagent Company Catalog number
MSgg composition potassium phosphate 5mM Roth 6878
MOPS 100mM Sigma-Aldrich M1254
Magnesium chloride 2mM Roth 2189.1
Calcium chloride 700μM Roth A119.1
Ferric chloride 50μM Sigma-Aldrich 157740
Zinc chloride 1μM Applichem A2076
Thiamine 2μM Sigma-Aldrich 74625
Glycerol 0.5% Roth 7533
Glutamate 0.5% Sigma-Aldrich 49621
Tryptophan 50μg/ml Sigma-Aldrich T0254
Phenylalanine 50μg/ml Sigma-Aldrich P2126
Cell fixation Paraformaldehyde Roth 0335
Name of the equipment Company Catalog number
Sonication Cell Sonicator Bandelin D-1000
Fluorescence Microscopy Fluorescence Microscope Leica DMI6000B
Name of the software Company Catalog Number
Fluorescence Microscopy AsaF Leica
Flow cytometry FCASDiva BD
Flow cytometry FlowJo Treestar

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Cite This Article
Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).

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