Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Summary

Микробные биопленки, как правило, составляет от различных субпопуляций специализированных клеток. Одноклеточный анализ этих подгрупп требует использования флуоресцентных журналистам. Здесь мы опишем протокол визуализировать и контролировать несколько subpopulationswithin

Abstract

Биопленки общий атрибут почти всех бактерий ^1-6. Когда бактерии образуют биопленки, клетки заключены в внеклеточный матрикс, который в основном составляют от белков и экзополисахариды, среди прочих факторов ^7-10. Микробного сообщества заключенная в биопленки часто показывает дифференциацию различных субпопуляций специализированных клеток ^11-17. Эти субпопуляции сосуществовать и часто показывают пространственную и временную организацию внутри биопленки ^18-21.

Биопленки в модели Сенная организма Bacillus требует дифференциации различных субпопуляций специализированных клеток. Среди них, субпопуляции матрицы производители, ответственные производить и выделять внеклеточного матрикса биопленки имеет важное значение для формирования биопленок ^11,19. Таким образом, дифференциация матрица производителей является отличительной чертой биопленки в B. Сенная.

Мы использовали флуоресцентные журналистам визуализировать и количественно субпопуляции матрица производителей биопленки Б. Сенная ^15,19,22-24. Конкретно, мы заметили, что субпопуляции матрица производителей отличается в связи с наличием собственного производства внеклеточного сигнала surfactin ^25. Интересно, что surfactin производится субпопуляции специализированные клетки отличается от субпопуляции производителей матрицы ^15.

Мы подробно в докладе технического подхода необходимо визуализировать и количественно субпопуляции матрица производителей и surfactin производителей в биопленки В. зиЫШз. Для этого, флуоресцентные журналистам генов, необходимых для производства матриц и surfactin производства вставляются в хромосомы B. Сенная. Репортеры выражаются только в субпопуляции специализированных клеток. Тогда, может быть субпопуляцииконтролируется с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии (см. рис 1).

Тот факт, что различные субпопуляции специализированных клеток многоклеточного сосуществовать в пределах сообщества бактерий дает нам различные точки зрения о регуляции экспрессии генов у прокариот. Данный протокол рассматривает этот феномен экспериментально и может быть легко адаптирована к любой другой модели работы, выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе фенотипических неоднородность в микробного сообщества.

Protocol

1. Маркировка B. Сенная и Анализ биопленки

1. Усиление с помощью ПЦР промоторной области гена. Мы покажем, как например, клонирование P _Тапа, промоутер генов, ответственных за производство белка Таса матрицы ^26. Клон Р _тапа в pkm008 вектор (созданные Rudner лаборатории, Гарвардской медицинской школы. Бостон, США) (рис. 2).
2. Линеаризации плазмиды ферментативного пищеварения (ферментов рекомендовал XhoI).
3. Вызвать природных компетенции в B. Сенная напряжение 168, выполнив один шаг протокола ранее описываемых Харвуд и резки ^27.
4. Добавить линеаризованной плазмиды в культуре клеток и компетентный выбор для спектиномицину сопротивление после двух часов инкубации.
5. Штаммы получены вставили конструкция в нейтральных локус amyE Б. Сенная двойной рекомбинации (рис. 4). Чтобы создатьдвойной надписью напряжения, интегрировать второй репортер в нейтральную КБСМ локуса с помощью плазмиды pDR183 мы представляем на рисунке 3. Вставьте этот репортер используя ту же технику мы описали выше для вставки журналистам клонированы в pKM008.
6. Передача репортер от напряжения 168 NCIB3610, который может формировать биопленки. Используйте SPP1 трансдукции фагом протокол ^28,29. Рост напряженности в донора TY среде (LB +10 мм MgSO ₄ +10 мкМ MnSO _4). Смешайте 200 мл культуры с 100 мкл разведения фага акций. Добавьте 3 мл мягком агаре через 30 мин инкубации и позволяют фага гало возникают при 37 ° C.
7. Соберите мягком агаре. Центрифуга его и передать супернатант думал шприц 0,22 мкм фильтр. Используйте этот супернатант заразить культуру получателя штамма выращивают в среде TY. Добавить 30 мкл до 10 мл культуры разбавляют 1:10. Выдержите в течение 30 минут и выберите для устойчивости к антибиотикам через 24 ч инкубации.
8. Seвыделите нужную колонии и вырастить его в ночь на LB при 37 ° C.
9. SPOT 3 мкл ночной культуры на твердой биопленки вызывающие среднего MSgg 1,5% агар ^30. Позвольте клеткам расти в течение 72 часов при температуре 30 ° С (рис. 3). После трех дней роста биопленки образуются на поверхности MSgg агар разработан комплекс морфологических архитектуру на поверхности агара.

2. Дисперсия биопленки и фиксации клеток

1. Удаление биопленки форма поверхности MSgg агар помощью зубочистки или пинцет. Согласованность биопленки позволит вам очистить ее от поверхности агара в один кусок.
2. Поместите биопленки в 3 мл PBS буфера и разогнать биопленки повторяющихся прохождении через пипетки или иглы. Кроме того, биопленки дисперсии можно сделать с помощью мягкой ультразвуком. Мягкий ультразвуком требуется 12 импульсов с выхода 3 и амплитудой 0,7 секунды.
3. Исправить образцы до одной клетки-анализа. Resuspenг 300 мкл суспензии клеток в 1 мл 4% раствора параформальдегида и инкубировать при комнатной температуре в течение ровно семь минут.
   Состав на 4% параформальдегид решение:
   2 г параформальдегида
   50 мл PBS буфера
   4 мкл 10 N NaOH
   Фильтр решение через 0,22 мкм фильтр и аликвоту
4. Вымойте клеток после фиксации в буфере PBS в три раза и ресуспендируют их в 300 мкл буфера PBS.

3. Флуоресцентной микроскопии

1. Залить 200 мкл 0,8% агарозном на предметное стекло и тщательно ее другой слайд. Снимите верхнюю слайд мягко после 2 минут, чтобы получить слой агарозы прикреплены к слайду дна.
2. Spot 2 мкл фиксированные клетки на поверхности слоя агарозы и накройте его стеклом микроскопа.
3. Поместите образец в флуоресцентный микроскоп. Мы используем флуоресцентный микроскоп Leica DMI6000B оснащен Leica CRT6000 iIluminatионной системы. Фильтры для YFP являются Ex: BP500/20, Em: BP535/30 и СФП являются Ex: BP426/20, Em: 480/40
4. Подвергать образец для возбуждения флуоресценции между 50-200 мс. Установить возбуждения период в соответствии с отрицательным контролем, который показывает не флуоресценции в условиях, отобранных для эксперимента.
5. См. флуоресценции изображение того же изображения, полученные с яркой области. Слияние двух изображений в одно изображение. Результаты, полученные из потока флуоресцентной микроскопии с помощью одного-меченных деформации несущих репортер P _Тапа-YFP представлены на рисунке 6.

4. Количественная оценка отдельных клеток методом проточной цитометрии

1. Дисперсных образцов основных клеток с использованием мягкого ультразвуком. Разрушать ультразвуком образца выполнения 2 серии из 12 импульсов с выходной мощностью 5 и амплитудой 0,7 секунды, чтобы разогнать скопления в отдельные клетки, не вызывая лизис клетки. Подтверждение эффективности клеточной дисперсии с помощью световой микроскопии. Разбавьте образцы 1:100 в буфере PBS до цитометрическим анализом. Мы используем проточной цитометрии BD FACS Песнь II. Для YFP флуоресценции, использование лазерного возбуждения при 488 нм в сочетании с 530/30 фильтров. Для CFP флуоресценции, использование лазерного возбуждения при 405 нм в сочетании с 408/40 фильтров.
2. Калибровка машины проточной цитометрии с двумя отрицательными контролями. Образец PBS буфера нет клеток в суспензии должна служить в качестве отрицательного контроля за размером частиц воспринимается проточной цитометрии. Пример помечены не флуоресценции репортера должно служить в качестве отрицательного контроля за флуоресценцию чувствительность проточной цитометрии.
3. Поместите образец помечены флуоресцентным репортером в проточной цитометрии. Для каждого образца, анализ по крайней мере 50 000 событий с расходом от 300 до 3000 событий в секунду.
4. Захват данных с использованием программного обеспечения СУИМ Diva (BD Biosciences) и анализировать его с помощью FlowJo 8.5.2 программного обеспечения. См. сигналов флуоресценции для контроля, которые показывают,нет флуоресценции.
5. Представить данные мониторинга сигнала флуоресценции одной-меченных напряжение в двух осях графика. Постройте флуоресценции обнаружена по оси X и числа клеток, экспрессирующих различные уровни флюоресценции по оси Y. Результаты, полученные с помощью проточной цитометрии анализ с помощью одного-меченных деформации несущих репортер P _Тапа-YFP представлены на рисунке 8.
6. Представить данные мониторинга флуоресцентного сигнала с двойной надписью напряжения в трех осях графика. Постройте флуоресцентного сигнала каждого из каналов, мониторинг в X и Y оси (например, GFP будет измеряться по оси Х и СФП в Y-ось). Земельный участок в Z-оси числа клеток, экспрессирующих каждый репортер и представить их в качестве контура изолиний, которая была бы перпендикулярна плоскости чертежа (рис. 9 и 10).

4. Представитель Результаты

Когда Б. Сенная растет на тарелку бiofilm вызывающие среднего MSgg, формирование биопленок наблюдается после трех дней инкубации при 30 ° C ^30. Биопленки показывает сильную последовательность и она может быть снята с поверхности агара в один кусок. Кроме того, биопленки показывает комплекс морфологических архитектуру, которая указывает на различные клетки участвуют групп населения (рис. 5). Например, производство внеклеточного матрикса в биопленки приводит к образованию морщин на поверхности колонии. Эта особенность может быть связана с дифференциацией субпопуляции матрица производителей ^19. Кроме того, повышение воздушных структур на поверхности биопленки указывает на наличие субпопуляции спорообразующих клеток, так как споры локализован в апикальной области этих структур ^30.

Примеры визуализации дифференцировки клеток в одном-меченых и дважды помечены деформации с помощью флуоресцентной микроскопии тepresented на рисунке 6 и 7, соответственно. Одного штамма помечены флуоресцентным таит в себе репортер P _{Тапа-CFP,} что выражается в субпопуляции матрицы продуцирующих клеток. Это субпопуляции отвечает производить и выделять внеклеточного матрикса, что представляет собой биопленки (рис. 6). Дважды помечены штамм таит в себе репортер P _Тапа-CFP ²⁶ и дополнительные репортер P _srfAA-YFP ^31. Это второй репортер позволяет контролировать субпопуляции клеток, ответственных выделяют сигнальные молекулы surfactin, который вызывает сигнального каскада к дифференциации производителей матрицы (рис. 7). Субпопуляции матрицы производители являются ложными окрашены в синий цвет, а субпопуляции производителей surfactin ложно окрашены в желтый цвет.

Проточная цитометрия анализ с помощью одного-меченных деформации несущих репортер P _Тапа-YFP представлена ​​на рисунке 8. Необработанные штамм управления не укрываетлюбой флуоресцентные гены белков показало, одной популяции низкой относительной флуоресценции. Клетки укрывательство P _Тапа-YFP в не биопленки вызывающие условия не дифференцировать субпопуляции матрица производителей и всего населения показала, низкой относительной флуоресценции. В биопленки вызывающие состояние, субпопуляции клеток с высокой относительной флуоресценции происходило, наблюдал, как плечо справа от низкой относительной флуоресценции пик ^23.

Результаты, полученные с помощью проточной цитометрии анализа с использованием двойной надписью деформации представлен на рисунке 9 и 10. Рисунок 9 мониторинг субпопуляций матрица производителей и производителей surfactin использованием двойной надписью штамм Р _{Тапа-CFP, P-srfAA} YFP. Как управления фоновой флуоресценции был использован штамм не укрывают любой флуоресцентные гены белков. Далее, мы обнаружили каждой подгруппе матриц производители и surfactin производителей в каждом канале флуоресценции, используя один-меченных деформации с в качестве контроля. Дважды помечены штамм Р _{Тапа-CFP, P-srfAA} YFP показал две субпопуляции клеток, экспрессирующих высокого уровня флуоресцентного журналистам. Каждая популяция оформлена, показывая, что нет совпадения по выражению журналистов двух подгруппах специализированных клеток ^15. Кроме того, проточной цитометрии анализа с использованием двойной надписью штамм Р _{SKF-YFP, P-тапа} YFP представлена ​​на рисунке 10. Репортер ген контролирует SKF дифференциации субпопуляций каннибалов ^32, который был описан дифференцировать согласованно с субпопуляции матрица производителей ^24. В этом случае дважды помечены штамма показали одну субпопуляции клеток, экспрессирующих люминесцентные и YFP и СФП. Это показывает, что оба пути дифференциации клеток будут согласованно активируются в тот же субпопуляции.

1.jpg "/>
Рисунок 1. Общая схема эксперимента. Протокол делится на три основных этапа. Первый шаг требует маркировки штамма B. Сенная с корреспондентом сплав, который следит за субпопуляции интерес. Во-вторых, рост меченых штаммов в биопленки, вызывающих условиях. В-третьих, разогнать биопленки и выполнять одноклеточные анализ населения с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Рисунок 2. Схематическое изображение pKM008 вектор интеграции. Этот вектор интегрируется репортер слияние интересов в нейтральной amyE локус двойной рекомбинации. Промоутер интерес (P _тапа) клонируют в вектора с использованием сайтов рестрикции EcoRI и HindIII. Тогда выражение гена CFP находится под контролем промотора P _Тапа. Orientatионов генов в плазмиды представляют, как стрела.

Рисунок 3. Схематическое изображение вектора интеграции pDR183. Этот вектор интегрируется репортер слияние интересов в нейтральной локус КБСМ двойной рекомбинации. Слияние интересов (P _Тапа - CFP) клонируют в вектора с использованием сайтов рестрикции EcoRI и BamHI. Ориентация генов в плазмиды представлена ​​в виде стрелки.

Рисунок 4. Схема интеграции журналистам в хромосому B. Сенная двойной рекомбинации. (A) B. Сенная хромосома имеет два нейтральных локусов, amyE и КБСМ, интегрировать репортер слияния, не влияя на развитие биопленки. (B) B. Сенная двойной рекомбинации. Корреспондент слияние интегрируется в нейтральном локусе в стабильной форме.

Рисунок 5. Биопленки Б. Сенная NCIB3610. Процесс формирования bioflm штамма B. Сенная NCIB 3610 при выращивании на биопленки вызывающие среднего MSgg в течение трех дней при температуре 30 ° C. Последовательные фотографии развитие биопленки были каждые 12 часов.

Рисунок 6. Визуализация субпопуляции матрица производителей под флуоресцентным микроскопом. Выборки из биопленки Б. Сенная P _Тапа - CFP было зафиксировано и исследуется под флуоресцентным микроскопом. 200 мс флуоресценциивозбуждения свидетельствует субпопуляции клеток излучающих выше флуоресценции, чем остальные клетки. Мы считаем это субпопуляции как субпопуляции матрица-продуцирующих клеток. Шкала бар 3 мкм.

Рисунок 7. Визуализация субпопуляции матрица производителей и surfactin производителей под флуоресцентным микроскопом. Пример из биопленки из B. Сенная P _{Тапа-CFP, P-srfAA} YFP дважды помечены штамм был зафиксирован и исследуется под флуоресцентным микроскопом. Выдержка из 250 мс свидетельствуют две субпопуляции клеток излучающих выше флуоресценции, чем остальные клетки. Один субпопуляции выразил YFP и он был обнаружен только использование канала YFP (ложный окрашены в желтый цвет). Это субпопуляции surfactin производителей. Другой субпопуляции выразил CFP и было исключительно обнаруженных с применением CFP Chann эл. Это субпопуляции матрица производителей. Шкала бар 3 мкм.

Рисунок 8. Количественное определение субпопуляции матрица производителей с использованием 2-D проточной цитометрии. Дисперсных клетки биопленки Б. Сенная P _Тапа-YFP было контролировать с помощью проточной цитометрии. Проточной цитометрии считается 50,000 событий и флуоресценции для каждого события следили. Количество ячеек считаются строится по оси Y, а интенсивность сигнала YFP строится по оси X. Клетки, выращенные в средней LB получить без биопленки условиях вызывающие. Клетки, выращенные в средней MSgg получить биопленки вызывающих условиях. Субпопуляции матрица производителей отличает только в биопленки, вызывающих условиях. Эта цифра была адаптирована с Лопесом и соавт., PNAS (2009) 106 :280-285.

s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg "/>
Рисунок 9. Количественное определение субпопуляции матрица производителей и surfactin производителей с использованием 3-D проточной цитометрии. Флуоресцентный сигнал каналов мониторинга представлены в оси X (для YFP) и Y оси (для CFP). Z-ось измеряет количество клеток, экспрессирующих каждый репортер и количественно, как контур изолинии, перпендикулярных к плоскости бумаги. Число событий, мониторинг в этом эксперименте было 50,000 событий. Левая верхняя панель представляет собой контроль фоновой флуоресценции укрывательство не флуоресцентные гены белков. Правая верхняя панель определяет субпопуляции surfactin производителей в YFP флуоресценции канал (оформлена в желтый цвет) с помощью одного-меченных штамм _Р-srfAA YFP. Левая нижняя панель определяет субпопуляции матрица производителей в CFP флуоресценции канал (оформлена в синий) с помощью одного-меченных штамм Р _{Тапа-CFP.} Дважды помечены штамм Р _тапа </ EM>, CFP, _P-srfAA YFP контролируется в правой панели внизу. Он показал две подгруппы, которые сформулированы в желтый и синий. Эта цифра была адаптирована с Лопесом и соавт., Гены и развития (2009) 23 :1631-1638.

Рисунок 10. Количественное определение субпопуляции матрица производителей и каннибалов с использованием 3-D проточной цитометрии. Флуоресцентный сигнал каналов мониторинга представлены в оси X (для YFP) и Y оси (для CFP). Число событий, мониторинг в этом эксперименте было 50.000. Правая верхняя панель определяет субпопуляции каннибалов в YFP флуоресценции канал (обрамленный желтым цветом) в одном-меченных штамм Р _SKF-YFP. Левая нижняя панель определяет субпопуляции матрица производителей в CFP флуоресценции канал (оформлена в синий) в одном-меченных штамм Р _{Тапа-CFP.} Гouble-меченных штамм Р _{Тапа-CFP,} P _SKF-YFP показали только один субпопуляции клеток по диагонали на X и Y оси (в зеленой рамке). Это субпопуляции обнаружен в канале YFP ​​и CFP, потому что она выражает двух журналистов одновременно. Лопес и соавт., Гены и развития (2009) 23 :1631-1638.

Discussion

Тот факт, что бактериальных сообществ показать субпопуляции клеток, экспрессирующих определенный набор генов, свидетельствует о сложности микробных сообществ ^33,34. Этот протокол должен помочь определить, является ли выражение любого интересующего гена ограничена определенной субпопуляции клеток в специализированные микробного сообщества. Визуализация этих подгрупп требует разработки новых методов, так как традиционные методы контроля экспрессии генов и анализ микрочипов скорость уровни экспрессии генов для всего микробного сообщества и колебания экспрессии генов в микробного сообщества, как правило, пропустили.

Люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии дополнение идеально подходит для анализа типов клеток обеспечить сочетание количественных и качественных, которые будут определять субпопуляции интерес. Ограничения и методы их необходимо ссылаться друг на друга для йэлектронной ради точности измерений. В случае с флуоресцентной микроскопии, интенсивность сигнала от флуоресцентных клеток (а иногда и размер субпопуляции) варьируется в зависимости от времени экспозиции для возбуждения образца (обычно от 50 до 200 мс). В случае проточной цитометрии однако, небольшие размеры бактериальных клеток ограничивает обнаружения и некоторых бактериальных не могут быть отслежены. Из-за ограничений размера ячейки, флуоресцентного сигнала излучаемого репортер должен быть достаточно высоким, чтобы обнаружение флуоресценции и именно из-за этого, мы испытывали проблемы в обнаружении клеток, экспрессирующих журналистам с низким уровнем экспрессии. Тем не менее, новый поток цитометрах теперь поставляются с более чувствительными предела обнаружения, который позволяет нам отслеживать бактериальных популяций более точно. Кроме того, тем выше чувствительность, предел обнаружения позволит тест для сортировки клеток, чтобы изолировать субпопуляции клеток, мы ИнтересТед в и провести анализ экспрессии генов в данной подгруппе.