の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

Protocol

1。ラベリングB.枯草菌とバイオフィルム形成アッセイ

1. PCRにより目的の遺伝子のプロモーター領域を増幅する。ここでは、例としてP _タパ 、TASAマトリックスタンパク質²⁶の産生に関与する遺伝子のプロモーターのクローニングを示しています。 pkm008ベクターへのクローンP _タパ （Rudnerラボ、ハーバード·メディカル·スクール、ボストン、米国で作成された）（図2）。
2. 酵素消化（酵素の推奨をXhoI）によりプラスミドを線形化します。
3. Bの自然な能力を誘発する枯草菌は、以前ハーウッドによって記述されたワンステップのプロトコルに従って^、27を切断^して 168株。
4. コンピテントセルの文化に線形化されたプラスミドを追加し、インキュベーション2時間後、スペクチノマイシン耐性のために選択します。
5. 得られた株は、B.の中性amyE座にコンストラクトを挿入した二重組換えによる枯草菌 （図4）。作成するには二重標識株を、我々は図3に存在するプラスミドpDR183を使用してニュートラル軌跡LACAに第2のレポーターを統合することができます。我々はpKM008にクローニングされた記者の挿入のために上記と同じテクニックを使用して、この記者を挿入します。
6. バイオフィルムを形成することができますNCIB3610にひずみ168からレポーターを転送します。 SPP1ファージ伝達プロトコル^28,29を使用^{しています} 。 TY培地（LB 10 mMのMgSO _4を 10μMのMnSO _4）のドナー系統を栽培しています。ファージ株の希釈液100μlで培養液200μlを混合します。インキュベーション30分後に柔らかい寒天の3ミリリットルを追加し、ファージハローは37℃が発生することができ℃の
7. 軟寒天を収集します。それを遠心分離し、上清を0.22μmのフィルターシリンジを考えて渡します。 TY培地で増殖させ、受信者の株の培養物を感染させるためには、この上清を使用しています。文化1:10に希釈し10mlに30μlを加える。 30分間インキュベートし、インキュベーションの24時間後に抗生物質耐性のために選択します。
8. SE37℃でコロニーをlectとLBで一晩、それを育てる℃に
9. 1.5％寒天³⁰ MSgg固体バイオ誘導培地で一晩培養の3μLを見つける。細胞は30°C（図3）で72時間の間に成長することができます。成長の三日後、MSgg寒天の表面に形成されたバイオフィルムは寒天の表面に複雑な形態のアーキテクチャを開発しました。

2。バイオフィルム分散と細胞固定

1. バイオフィルムの形の爪楊枝やピンセットを使用してMSgg寒天の表面を削除します。バイオフィルムの一貫性は、1つのピースで寒天の表面から剥離それをオフにできるようにする必要があります。
2. PBS緩衝液3ml中でバイオフィルムを置き、ピペットまたは注射針を介して繰り返し通すことによってバイオフィルムを分散させる。また、バイオフィルムの分散は、軽度の超音波を用いて行うことができます。軽度の超音波処理は12 3の出力を持つパルスと0.7秒の振幅を必要とします。
3. 試料の前のセル単一の分析を修正します。 Resuspen正確に 7分間、室温で4％パラホルムアルデヒド溶液とインキュベートし、1 mlの細胞懸濁液のd 300μL。
   4％パラホルムアルデヒド溶液の組成：
   パラホルムアルデヒドの2グラム
   PBS緩衝液50 mlの
   4μlの10 N NaOHで
   0.22 umのフィルターとアリコートを通じてソリューションをフィルタリングする
4. PBS緩衝液で固定3時間後に細胞を洗浄し、PBSバッファー300μlで再懸濁します。

3。蛍光顕微鏡検査法

1. 顕微鏡スライド上に0.8％アガロースの200μLを入れ、慎重に別のスライドでそれをカバーしています。下部のスライドに取り付けられたアガロースの層を得るために、2分後にそっと上部のスライドを削除します。
2. アガロース層の表面上に固定された細胞の2μLを発見し顕微鏡のカバーガラスでそれをカバーしています。
3. 蛍光顕微鏡でサンプルを置きます。我々は、ライカCRT6000 iIluminatを装備した蛍光顕微鏡ライカDMI6000Bを使用しシステムイオン。 YFP用のフィルタは、Exは次のとおりです。BP500/20、EM：BP535/30とCFPのためには、Exは次のとおりです。BP426/20、EM：40分の480
4. あなたのサンプルを公開 50から200ミリ秒の間に励起蛍光に。実験のために選択した条件には蛍光を示さないネガティブコントロールに応じて励磁期間を設定します。
5. 明視野で得られた同じ画像に蛍光画像を参照してください。一つの絵に2つの画像をマージします。結果は、レポーターP _タパ -YFPを保有する単一の標識株は図6で表されている使用してフロー蛍光顕微鏡から得られた。

4。フローサイトメトリーを用いた単一細胞の定量化

1. 軽度の超音波を使用して固定された細胞のサンプルを分散させる。細胞溶解を引き起こすことなく、単一の細胞に細胞塊を分散させるために、5の出力と0.7秒の振幅で12パルスの2シリーズを実行してサンプルを超音波処理してください。光学顕微鏡で細胞分散の効率を確認してください。 フローサイトメトリー分析の前にPBS緩衝液でサンプル1:100に希釈する。我々は、フローサイトメーターBD FACSカントIIを使用しています。 YFP蛍光のために、30分の530フィルターと相まって488nmでレーザー励起を使用しています。 CFPの蛍光については、40分の408フィルターと相まって、405 nmでレーザー励起を使用しています。
2. 2ネガティブコントロールでフローサイトメトリーマシンのキャリブレーションを行います。懸濁液中の無細胞をPBS緩衝液のサンプルはフローサイトメーターで検出された粒子の大きさの負のコントロールとして使用する必要があります。無蛍光レポーターで標識されたサンプルは、フローサイトメーターの蛍光感度のネガティブコントロールとして使用する必要があります。
3. フローサイトメーターで蛍光レポーターで標識されたサンプルを配置します。各サンプルについて、毎秒300と3000のイベント間の流量の少なくとも50,000のイベントを分析します。
4. FACSの歌姫ソフトウェア（BD Biosciences）を用いてデータをキャプチャしFlowJo 8.5.2ソフトウェアを使用してそれを分析します。表示コントロールに蛍光シグナルを参照してください。の無蛍光。
5. 2軸グラフィック内の単一標識株の蛍光シグナルを監視してデータを提示します。 X軸とY軸に蛍光の異なるレベルを発現する細胞の数が検出された蛍光シグナルをプロットします。結果は、P _タパ -YFPが図8で表されているレポーターを保有する単一の標識株を用いたフローサイトメトリー分析から得られた。
6. 3軸グラフィックで二重標識株の蛍光シグナルを監視してデータを提示します。 X軸とY軸（例えば、GFPをY軸のX軸とCFPで測定されるでしょう）でモニタリングチャネルのそれぞれの蛍光シグナルをプロットします。 Z軸にプロット各レポーターを発現する細胞の数や紙の平面（図9および10）に垂直になる等高線等高線としてそれらを提示します。

4。代表的な結果

時B.枯草菌は、bのプレート上に成長iofilm誘導培地MSgg、バイオフィルム形成は^{、30℃30℃}のインキュベーションの3日後に観察される。バイオフィルムは強力な一貫性を示し、それは一枚で寒天の表面から剥離することができます。また、バイオフィルムは、異なる参加する細胞集団（図5）の指標となる複雑な形態のアーキテクチャを示しています。例えば、コロニーの表面のしわの形成バイオフィルムの結果で細胞外マトリックスの生産。この機能は、マトリックスの生産¹⁹の集団の分化と相関することができます。胞子はこれらの構造体³⁰の頂端領域に局在して以来、同様に、フィルムの表面上の空中構造の調達は、胞子形成細胞の亜集団の存在を示している。

単一標識と蛍光顕微鏡を用いた二重標識株があるrの細胞分化の可視化の例それぞれ、図6および7にepresented。単一標識株は蛍光レポーターを抱いマトリックス産生細胞の亜集団に発現しているP _タパ -CFP。この集団は、（図6）バイオフィルムを構成する細胞外マトリックスを生成し、分泌する責任があります。二重標識株はレポーターを抱いP _タパ -CFP ²⁶と追加のレポーターP _srfAA-YFP ^31。この第2のレポーターは、行列の生産の分化（図7）へのシグナル伝達カスケードを引き起こすシグナル伝達分子のサーファクチンを分泌する責任細胞の集団を監視することができます。サーファクチン生産者の集団が黄色に着色された偽の間マトリックスの生産者の集団は青で着色された偽である。

レポーターP _タパ -YFPを保有する単一の標識株は図8に示されている。用いたフローサイトメトリー分析未処理の対照株かくまっていない任意の蛍光タンパク質遺伝子は、単一の人口低い相対蛍光を示した。非バイオ誘導条件でP _タパ -YFPを保有する細胞は、マトリックスの生産者の集団を区別しておらず、全体の人口が相対的に低い蛍光を示した。バイオ誘導条件では、高い相対蛍光を持つ細胞の亜集団は、低相対蛍光ピーク²³の右側に肩として観測し、発生しました。

二重標識株を用いたフローサイトメトリー分析から得られた結果を図9および10で表されます。図9は、二重標識株をP _タパ -CFP、P _srfAA-YFPを使用してマトリックスの生産者とサーファクチン生産者の集団を監視した。バックグラウンド蛍光の制御として、我々は、任意の蛍光タンパク質遺伝子を保有しない菌株を使用していました。次に、我々は、単一の標識株を用いて、各蛍光チャンネルにマトリックスの生産者とサーファクチン生産者の各集団を検出コントロールとしての。二重標識株をP _タパ -CFP、P _srfAA-YFPの蛍光レポーターの高いレベルを発現する細胞の2集団を示した。各集団は、特殊なセル¹⁵の2集団間での記者の発現の重複がないことを示す、フレーミングされています。二重標識株をP _SKF-YFPを用いて同様に、フローサイトメトリー分析、P _タパ -YFPは、図10に示されています。遺伝子SKFの記者は、行列の生産²⁴の集団で協調的に区別するために記載されている人食い³²の集団の分化を監視します。このケースでは、二重標識株は、YFPとCFPの両方を発現する蛍光細胞の単一集団を示した。これは、両方の細胞の分化経路が協調的に同一の集団で活性化されることが示された。

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図1。実験の全体的なスキーム。プロトコルは主に3つのステップに分かれています。最初のステップは、Bの系統を標識する必要があります興味のある集団を監視するレポーター融合した枯草菌 。第二に、バイオ誘導条件で標識した系統を栽培しています。第三に、バイオフィルムを分散させ、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて、人口の単一細胞解析を実施しています。

図2。統合ベクタpKM008の略図はこのベクトルは、二重組換えによって中性軌跡amyEに興味のあるレポーター融合を統合しています。興味（P _タパ ）のプロモーターは、制限部位EcoRIおよび HindIII を用いてベクターにクローニングされています。その後、CFP遺伝子の発現は、プロモーターP _タパの制御下にある。 orientatプラスミドの遺伝子のイオンは、矢印で表されます。

図3。統合ベクトルpDR183の略図はこのベクトルは、二重組換えによって、中立座LACAに興味のあるレポーター融合を統合しています。興味の融合（P _タパ - CFP）は、制限部位EcoRIおよび BamHI を用いてベクターにクローニングされています。プラスミドの遺伝子の向きは矢印で表されます。

図4。 Bの染色体への記者の統合のスキーム二重組換えによる枯草菌 。 （A）B. 枯草菌の染色体はバイオフィルムの開発に影響を与えずに、レポーター融合を統合するために2つの中立座、amyEとLACAを持っています 。（B） Bのゲノムに組み込ま二重組換えによる枯草菌 。レポーターの融合は、安定的に中性の座に統合されています。

図5。 Bのバイオフィルム形成歪Bのbioflm形成の枯草菌 NCIB3610はプロセス枯草菌 NCIB 3610を30で3日間の間にバイオフィルムを誘発する媒体MSggに生育℃、バイオフィルムの発達の連続した​​画像は、すべて12hを撮影された。

図6。蛍光顕微鏡下でマトリックスの生産者の集団の可視化。Bのフィルムからのサンプル枯草菌 P _タパ - CFPは、蛍光顕微鏡下で固定されており、検討した。蛍光の200ミリ秒励起は、細胞の残りの部分よりも高い蛍光を発する細胞の集団を証明。我々は、マトリックス産生細胞の集団として、この集団を考慮した。スケールバーは、3μmである。

図7。蛍光顕微鏡下でマトリックスの生産者とサーファクチン生産者の集団の可視化。Bのフィルムからのサンプル枯草菌P _タパ -CFP、P _srfAA-YFP二重標識株が固定されており、蛍光顕微鏡下で観察した。残りのセルよりも高い蛍光を発する細胞の250 msの証明2集団の露光時間。一集団は、YFPを発現し、それが排他的にYFPチャンネル（黄色で着色された偽）を使用して検出された。これは、サーファクチン生産者の集団です。別の集団では、CFPを表明し、それが排他的にCFP channを用いて検出したエル。これは、行列の生産者の集団です。スケールバーは、3μmである。

図8。 2-Dフローサイトメトリーを用いて行列の生産者の集団の定量化は 、Bのバイオフィルムから細胞を分散枯草菌 P _タパ -YFPは、フローサイトメトリーを用いてモニターした。フローサイトメーターは、50.000のイベントをカウントし、各イベントの蛍光シグナルをモニターした。 YFP信号の強度をX軸にプロットされている間計数した細胞の数はY軸にプロットされます。細胞は、非バイオ誘導条件を得るためにLB培地で増殖させた。細胞は、バイオ誘導条件を得るために媒体をMSggで増殖させた。行列の生産者の集団は、バイオ誘導条件で区別されます。この数字は·ロペスらから適応されました。、PNAS（2009）106 :280-285。

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図9。 3-Dフローサイトメトリーを用いて行列の生産者とサーファクチン生産者の集団の定量化。監視チャンネルの蛍光シグナルは、X軸（YFP）とY軸（CFPのために）に示されています。 Z軸は、各レポーターを発現する細胞数を測定し、輪郭の孤立線が紙面に垂直なそれが定量化されます。この実験でモニターされるイベントの数は、50.000のイベントでした。左上のパネルは蛍光タンパク質遺伝子を保有しないバックグラウンド蛍光の制御を提供します。右上のパネルには、単一の標識菌株P _srfAA-YFPを使用してYFP蛍光チャネル（黄色で囲まれ）のサーファクチン生産者の集団を検出します。左下のパネルには、単一の標識菌株P _タパ -CFPを使用して、CFPの蛍光チャネル（青枠で囲ま）で行列の生産者の集団を検出します。二重標識株をP _タパ </ em>は-CFP、P _srfAA-YFPは、右下のパネルで監視されています。それは黄色と青枠で囲まれる2つの集団を示した。この数字は（2009）·ロペスら 、遺伝子開発から23 :1631-1638適応されました。

図10。行列の生産および3-Dフローサイトメトリーを用いて人食い人種の集団の定量化。監視チャンネルの蛍光シグナルは、X軸（YFP）とY軸（CFPのために）に示されています。この実験でモニターされるイベントの数は50.000であった。右上のパネルには、単一の標識菌株P _SKF-YFPのYFP蛍光チャネル（黄色の枠で）で人食いの亜集団を検出します。左下のパネルには、単一の標識菌株P _タパ -CFP CFPの蛍光チャネル（青枠で囲ま）で行列の生産者の集団を検出します。 Double標識株をP _タパ -CFP、P _SKF-YFPは、X軸とY軸（緑の枠で）に対角のセルの唯一の集団であった。それは同時に二つの記者を表現するため、この集団は、YFPとCFPチャンネルで検出されます。ロペスら 、遺伝子と開発（2009）23 :1631-1638。

Discussion

細菌群集は、特定の遺伝子の証拠一連の微生物群集^33,34の複雑性を発現する細胞の集団を示しているという事実。このプロトコルは、関心のある任意の遺伝子の発現が微生物群集内に特殊化した細胞の特定の集団に限定されているかどうかを判断するのに役立ちます。伝統的な方法は、全体の微生物群集と微生物群集内で遺伝子発現の変動に遺伝子発現やマイク​​ロアレイ解析率遺伝子発現のレベルを一般的に見逃して監視するので、これらの集団の可視化は、新しい技術の開発を必要とします。

蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーは、関心のある集団の定義する定性的および定量的な組み合わせを提供するために、細胞の種類の分析のために理想的に補完します。両方の技術の限界は、番目のためにお互いを参照するために彼らが必要なように測定の精度の電子酒。蛍光顕微鏡の場合には、蛍光細胞（時には集団の大きさ）からの信号の強度は、サンプル（通常は50〜200ミリ秒の間）に励起するために使用される露光時間に応じて異なります。しかし、フローサイトメトリーの場合には、細菌細胞のサイズが小さい検出を制限し、いくつかの細菌は、監視することはできません。セルのサイズ制限のため、レポーターから放出される蛍光シグナルは蛍光の検出を可能にすると、正確にこのために十分高くなければならない、我々は、低い発現レベルで記者を発現する細胞の検出の問題を経験しています。ただし、新しいフローサイトメーターは、現在私たちはより正確な方法で細菌の集団を監視することができ、より高感度な検出限界、が付属しています。さらに、検出限界の高感度は、我々がinteresある細胞の亜集団を分離するために、細胞選別のためのアッセイに私達を許可しますテッドはで、この特定の集団における遺伝子発現解析を実施しています。