Mikrobiella biofilmer i allmänhet utgörs av distinkta subpopulationer av specialiserade celler. Enkel-cell-analys av dessa underpopulationer kräver användning av fluorescerande reportrar. Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera och övervaka flera subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilmer med fluorescens-mikroskopi och flödescytometri.
Biofilm formation är en allmän egenskap att nästan alla bakterier 1-6. När bakterier bilda biofilmen, celler är inneslutna i extracellulär matrix som i huvudsak utgöres av proteiner och exopolysackarider, bland andra faktorer 7-10. Den mikrobiella innesluten i biofilmen ofta visar differentiering av distinkta subpopulation av specialiserade celler 11-17. Dessa subpopulationer samexistera och ofta visar rumsliga och tidsmässiga organisation inom biofilmen 18-21.
Biofilm bildning i Bacillus modellorganism subtilis kräver differentiering av olika subpopulationer av specialiserade celler. Bland dessa är den subpopulation av matrix tillverkare, som är ansvariga för att producera och utsöndra den extracellulära matrisen av biofilmen väsentlig för bildning av biofilm 11,19. Därför är differentiering av matris producenter ett kännetecken för biofilm bildning i B. subtilis.
Vi har använt fluorescerande reportrar att visualisera och kvantifiera subpopulationen av matrisen producenter i biofilmer av B. subtilis 15,19,22-24. Konkret har vi observerat att subpopulationen av matrisen producenter skiljer svar på närvaron av egenproducerade extracellulär signal surfaktin 25. Intressant nog är surfaktin som produceras av en subpopulation av specialiserade celler som skiljer sig från den subpopulation av matrix tillverkare 15.
Vi har i denna rapport den tekniska lösning som krävs för att visualisera och kvantifiera subpopulationen av matrisen producenter och producenter surfaktin inom biofilmen av B. subtilis. För att göra detta är fluorescerande reportrar av gener som krävs för matrix produktion och surfaktin produktionen in i kromosomen av B. subtilis. Reportrar uttrycks endast i en subpopulation av specialiserade celler. Därefter kan de vara subpopulationerövervakades med användning av fluorescens-mikroskopi och flödescytometri (se fig. 1).
Det faktum att olika subpopulationer av specialiserade celler samexisterar inom flercelliga grupper av bakterier ger oss ett annat perspektiv om regleringen av genuttryck i prokaryoter. Detta protokoll behandlar detta fenomen experimentellt och kan enkelt anpassas till en annan arbetsmodell, för att belysa de molekylära mekanismerna bakom fenotypisk heterogenitet inom en mikrobiell gemenskap.
Det faktum att bakteriella samhällen visar subpopulationer av celler som uttrycker viss uppsättning av gener bevis komplexiteten i mikrobiella samhällen 33,34. Detta protokoll bör hjälpa till att bestämma huruvida expressionen av varje gen av intresse är begränsad till en särskild underpopulation av specialiserade celler inom den mikrobiella. Visualisering av dessa subpopulationer kräver utveckling av nya tekniker, eftersom traditionella metoder för att övervaka genuttryck eller microarray analys …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansieras av Young Investigator Research Program, från Centrum för Infektionsmedicin Disease Research (Zinf) från universitetet i Würzburg. Juan C Garcia-Betancur är doktorandstipendiat från Graduate School of Life Sciences (GSL) vid universitetet i Würzburg.
Technique | Name of the reagent | Company | Catalog number |
MSgg composition | potassium phosphate 5mM | Roth | 6878 |
MOPS 100mM | Sigma-Aldrich | M1254 | |
Magnesium chloride 2mM | Roth | 2189.1 | |
Calcium chloride 700μM | Roth | A119.1 | |
Ferric chloride 50μM | Sigma-Aldrich | 157740 | |
Zinc chloride 1μM | Applichem | A2076 | |
Thiamine 2μM | Sigma-Aldrich | 74625 | |
Glycerol 0.5% | Roth | 7533 | |
Glutamate 0.5% | Sigma-Aldrich | 49621 | |
Tryptophan 50μg/ml | Sigma-Aldrich | T0254 | |
Phenylalanine 50μg/ml | Sigma-Aldrich | P2126 | |
Cell fixation | Paraformaldehyde | Roth | 0335 |
Name of the equipment | Company | Catalog number | |
Sonication | Cell Sonicator | Bandelin | D-1000 |
Fluorescence Microscopy | Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000B |
Name of the software | Company | Catalog Number | |
Fluorescence Microscopy | AsaF | Leica | |
Flow cytometry | FCASDiva | BD | |
Flow cytometry | FlowJo | Treestar |