इस अध्ययन के एक उपन्यास microplate परख कि मानव प्लाज्मा में आतंच थक्का गठन है जो पहले नहीं बताया गया है के दौरान FV जमावट गतिविधि उपाय का वर्णन करता है. 405nm पर मानव प्लाज्मा में आतंच थक्का गठन के दौरान लगातार absorbance में बदलने के उपाय के लिए एक गतिज microplate पाठक विधि का उपयोग करता है.
In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only μl quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity – 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.
गतिज microplate परख विधि एक उपन्यास, मानव प्लाज्मा के नमूने जो (FV परख 1-चरण) या नहीं में FV जमावट गतिविधि की माप के लिए तेजी से, सस्ती और सुविधाजनक तकनीक के विकास की रूपरेखा जानबूझकर किया गया है साथ जोड़ा थ्रोम्बिन (FV सक्रिय दो चरण) परख. परख गतिज microplate पाठक का इस्तेमाल करता है और सभी सामग्री और अभिकर्मकों की आवश्यकता है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं या घर में किया जा सकता है. परख लगातार 405nm पर आतंच थक्का गठन के दौरान प्लाज्मा के प्रकाश तितर बितर में परिवर्तन पर नज़र रखता है. microplate परख छोटे प्लाज्मा नमूना संस्करणों (μl) का उपयोग करने का फायदा है और एक साथ एकाधिक नमूने (12) के विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है. ये परख विशेषताओं फायदेमंद हैं जब महंगे उपकरण और अभिकर्मकों (स्वचालित analyzers और फैक्टर कमी plasmas) का उपयोग किया जाता है, केवल छोटा सा नमूना मात्रा उपलब्ध हैं (रोगी plasmas) या FV शुद्धि च के दौरान नमूनों की एक बड़ी संख्या (विश्लेषणरॉम प्लाज्मा).
FV microplate परख जोड़ा लाभ है कि यह सुविधाजनक है, तेज है, और अलगाव और आवश्यक घटक घटकों के शोधन की आवश्यकता नहीं है. पुस्तिका झुकाव ट्यूब 3, 4 और स्वचालित 5-7 FV assays कि सूचना दी गई है के साथ तुलना में, FV microplate परख थक्का बार की तुलना उपयोगी रेंज (25-75 सेकंड) और नमूना में इसी FV स्तर (.5-0.005 इकाइयों / एमएल), और / संवेदनशीलता का पता लगाने सीमा (20-80pM). पुस्तिका झुकाव ट्यूब FV assays जो थक्का गठन 3, 4 के एक व्यक्तिपरक दृश्य मूल्यांकन से पीड़ित के साथ तुलना में, FV microplate परख थक्का समय के उद्देश्य और मात्रात्मक माप, प्रारंभिक दर, और आतंच थक्का गठन की हद तक परमिट. स्वचालित FV assays जो महंगी analyzers और अभिकर्मकों 5-7 की आवश्यकता से पीड़ित के साथ तुलना में, FV microplate परख अभिकर्मकों और सामग्री सस्ती कर रहे हैं और सभी आवश्यक सामग्री purcha हो सकता हैव्यावसायिक तौर पर sed या घर में बनाया. मैनुअल झुकाव ट्यूब 3, 4 और स्वचालित 5-7 FV assays आमतौर पर केवल थक्का गठन के लिए समय प्रदान करते हैं, समय नहीं प्रारंभिक दर, और आतंच थक्का गठन है जो सभी सही FV microplate परख के साथ spectrophotometrically मापा की हद तक. अंत में, झुकाव ट्यूब मैनुअल 3,4 और स्वचालित 5-7 FV assays केवल प्लाज्मा नमूनों में एक समय में एक FV गतिविधि को मापने के लिए सक्षम किया जा रहा से पीड़ित हैं, जबकि FV microplate परख करने के लिए उत्तरदायी है और उच्च throughput 12 नमूने हो सकता है एक साथ assayed.
microplate परख को दिखाना है कि 9 डीआईसी रोगी plasmas में FV कम NHP में देरी थक्का बार और FV परख एक चरण में थक्का गठन के कम शुरूआती दरों का एक संयोजन की वजह से सक्रिय था करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. डीआईसी रोगी plasmas में FV परख दो चरण में थक्का गठन की प्रारंभिक दरें NHP से नहीं बदला गया था. डीआईसी Patien में थक्का गठन का विस्तारटी plasmas भी 1 चरण FV और 2 चरण assays में NHP से बदल नहीं किया गया. FV कम एक चरण, 2 – मंच, और कुल गतिविधियों अन्य अध्ययन के साथ इस अधिग्रहीत रक्त विकार के रोगजनन दौरान अनुसार वृद्धि की FV खपत 19 और / या छह निष्क्रियता के कारण हो सकता है. डीआईसी plasmas में थक्का गठन की हद NHP के साथ मनाया के रूप में एक ही था को देखते हुए, इस चर FV की कमी प्लाज्मा में फाइब्रिनोजेन एकाग्रता का एक परिणाम होने की संभावना है और रोगी plasmas की विशेषताओं के लिए संबंधित नहीं था.
microplate परख से परिणाम संकेत दिया है कि मानव प्लाज्मा के नमूने में FV गतिविधि के माप थक्का गठन के समय और प्रारंभिक दर FV परख एक चरण से और थक्का और दो FV से कुल गतिविधि गठन के समय से प्राप्त किया जा सकता है – मंच परख. यह संभव करने के लिए एक प्लाज्मा नमूने में टी में थक्का गठन की सीमा के आधार पर FV गतिविधि के मात्रात्मक माप प्राप्त नहीं था1 FV वह और 2 चरण assays या FV परख दो चरण में थक्का गठन के प्रारंभिक दर. सभी प्रतिक्रियाओं लगभग 0.35 का थक्का गठन के उसी हद तक पहुँच को देखते हुए पहले प्रारंभिक के absorbance और thromboplastin और कैल्शियम क्लोराइड इसके अलावा के बाद अधिक से अधिक absorbance के बीच 0.45 इकाइयों, थक्का गठन की हद तक की माप में एक FV गतिविधि के मात्रात्मक आकलन प्रदान नहीं करता है प्लाज्मा नमूना दिया.
उपन्यास microplate परख FV गतिविधि के मानव और मानव और पशुओं के प्लाज्मा से शोधन के दौरान प्लाज्मा fractions के नमूने में माप के लिए अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग में उपयोग मिल जाएगा. microplate परख के लिए समय, प्रारंभिक दर और थक्का गठन की हद तक को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मानकों को एक साथ पुस्तिका झुकाव ट्यूब assays और स्वचालित जमावट analyzers में आम तौर पर निगरानी नहीं की. यह जानकारी थक्का गठन घटना के दौरान FV की भागीदारी की एक पूरी मात्रात्मक मूल्यांकन के अधिक प्रदान करता हैमानव प्लाज्मा में से पहले किया गया है 3-7 की सूचना दी. यह जानकारी दोनों अनुसंधान और नैदानिक प्रयोगशालाओं में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब प्लाज्मा के नमूनों में FV गतिविधि में या FV या FVA शुद्ध महत्वपूर्ण बदलाव को मापने. FV microplate परख भी विशेषताएँ और यौगिकों कि को सक्रिय या निष्क्रिय हो सकता है FV और FVA उपाय शिरापरक घनास्त्रता के लिए जोखिम में रोगियों में FV गतिविधि को मापने के FV Leiden उत्परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में 20, 21 और की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है FV प्लाज्मा से अपनी शोधन के दौरान.
FV microplate आसानी से बाह्य, आंतरिक, या आम मार्ग में किसी भी जमावट कारक की गतिविधि को मापने के लिए अनुकूलनीय परख उपयुक्त प्लाज्मा कारक की कमी का उपयोग कर रहा है और आतंच गठन के लिए अभिकर्मकों की शुरुआत कर रहा है. परख अनुसंधान और नैदानिक प्रयोगशालाओं में अपनी गतिविधि के और अधिक सटीक और पूर्ण माप के माध्यम से FV जैव रसायन की हमारी समझ में वृद्धि होगी. परमly, इस जानकारी पहले निदान और डीआईसी के रूप में जमावट विकारों, से पीड़ित व्यक्तियों के लिए और अधिक प्रभावी उपचार के विकास के माध्यम से सकारात्मक वातावरण स्वास्थ्य को प्रभावित करेगा.
The authors have nothing to disclose.
अनुसंधान के ओंटारियो प्रौद्योगिकी संस्थान (UOIT) विश्वविद्यालय से व्यावसायिक विकास और अनुसंधान स्टार्टअप फंड डॉ. जॉन ए Samis और स्वास्थ्य अनुसंधान स्वास्थ्य पेशेवर छात्र अनुसंधान Irina Levit पुरस्कार के एक कनाडाई संस्थानों के साथ समर्थन किया था. लेखक उसे वीडियो तैयार करने में सहायता के लिए शान्नोन Everett (शिक्षण और लर्निंग सैंटर, UOIT) को स्वीकार करते हैं. लेखकों उसकी सदस्यता, अंतर्दृष्टि और उपयोगी विचार विमर्श के लिए डॉ. माइकल ई. Nesheim (जैव रसायन विभाग, रानी के विश्वविद्यालय, किंग्स्टन, पर) को स्वीकार करते हैं. लेखकों को भी डीआईसी रोगी अध्ययन में इस्तेमाल plasmas प्रदान करने के लिए डा. चेंग ओल (Roald Dahl Haemostasis और घनास्त्रता केन्द्र, रॉयल लिवरपूल विश्वविद्यालय अस्पताल, लिवरपूल, ब्रिटेन) तो स्वीकार करते हैं.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
NaCl | Fisher | BP358-212 | |
Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |