Denna studie beskriver en ny mikroplatta analys som mäter FV koagulation aktivitet under fibrin koagelbildning i human plasma som inte har rapporterats tidigare. Metoden använder en kinetisk mikroplattläsare att kontinuerligt mäta förändringen i absorbans vid 405 nm under fibrin koagelbildning i humanplasma.
Som svar på skada, är blodets koagulation aktiveras och resulterar i generering av koagulering proteaset, trombin. Trombin klyver fibrinogen till fibrin, som bildar ett olösligt koagel som stoppar blödning. Faktor V (FV) i sin aktiverade form, FVa, är en kritisk kofaktor för proteaset FXa och accelerator av trombin under fibrin koagelbildning som en del av protrombinas 1, 2. Manuella FV analyser har beskrivits 3, 4, men de är tidskrävande och subjektivt. Automatiserade FV analyser har rapporterats 5-7, men analysatorn och reagensen är dyra och i allmänhet ger endast koaglet tid, inte hastigheten och omfattningen av fibrinbildning. Mikroplattan plattformen föredrages för mätning enzymkatalyserade händelser på grund av bekvämlighet, tid, kostnad, liten volym, kontinuerlig övervakning, och hög genomströmning 8, 9. Mikroplattor analyser har rapporterats för koagellys 10, trombocytaggregation11, och koagulationsfaktorer 12, men inte för FV aktivitet i human plasma. Målet med metoden var att utveckla en mikroplatta analys som mäter FV aktivitet under fibrinbildning i humanplasma.
Denna nya mikrotiterplatta beskriver en enkel, billig och snabb analys av FV aktivitet i human plasma. Analysen utnyttjar en kinetisk mikroplattläsare att övervaka absorbans förändring vid 405 nm under fibrinbildning i human plasma (Figur 1) 13. Analysen mäter exakt tid, initial hastighet, och omfattningen av fibrin koagelbildning. Det kräver endast il mängder av plasma, är fullständig inom 6 minuter, har hög genomströmning, är känsligt för 24-80pM FV, och mäter mängden av oavsiktligt aktiverade (1-steg aktivitet) och trombin-aktiverat FV (2-steg aktivitet ) för att erhålla en fullständig bedömning av dess totala funktionell aktivitet (2-steg aktivitet – 1-fas aktivitet).
Spridda intravasrör enskilda koagulation (DIC) är en förvärvad koagulopati som oftast utvecklas från befintliga infektioner 14. DIC är associerad med en dålig prognos och ökar dödligheten över den redan existerande patologi 15. Analysen användes för att visa att i 9 patienter med DIC, FV 1-steg, 2-stegs, och totala aktiviteter minskade, i genomsnitt, med 54%, 44%, och 42%, respektive, jämfört med normal poolad human referens plasma (NHP).
FV mikroplatta analysen lätt kan anpassas för att mäta aktiviteten av en koagulationsfaktor. Denna analys kommer att öka vår förståelse av FV biokemi genom en mer korrekt och fullständig mätning av sin verksamhet i forskning och kliniska situationer. Denna information kommer att positivt påverka hälso miljöer genom tidigare diagnos och utveckling av mer effektiva behandlingar för koagulationsstörningar, såsom DIC.
Den kinetiska mikrotiterplatta analysförfarande beskriver utvecklingen av en ny, snabb, billig och lämplig teknik för mätning av FV koagulering aktivitet i prover av mänskligt plasma som inte har (FV 1-stegs-analys) eller avsiktligt har aktiverats med tillsatt trombin (FV 2-stegs-analys). Analysen utnyttjar en kinetisk mikroplattläsare och allt material och nödvändiga reagens är kommersiellt tillgängliga eller kan göras internt. Analysen övervakar kontinuerligt förändringen i ljusspridning av plasma under fibrin koagelbildning vid 405 nm. Mikroplattan analys har fördelen med att använda små volymer plasmaprov (il) och är mottaglig för analys av multipla prover samtidigt (upp till 12). Dessa analysbetingelser attribut är fördelaktiga när dyr utrustning och reagens används (Automated analysatorer och Faktor-brist plasma), endast små prowolymer är tillgängliga (Patient plasmor) eller analys av ett stort antal prover (Under FV rening from plasma).
FV mikroplatta analysen har den extra fördelen att det är bekvämt, snabbt och kräver inte isolering och rening av de nödvändiga ingående komponenter. Jämfört med manuell tilt-rör 3, 4 och automatiserade 5-7 FV-analyser som har rapporterats har FV mikroplattan analysen jämförbar användbar utbud av koagel gånger (25-75 sek) och motsvarande FV nivåer i provet (0,5 till 0,005 enheter / ml) och känslighet / detektionsgränser (20-80pM). Jämfört med manuell tilt-rör FV analyser som lider av en subjektiv visuell bedömning av koagelbildning 3, 4, tillåter FV mikroplattan analysen objektiv och kvantitativ mätning av koagel tid, initial hastighet, och omfattningen av fibrin koagelbildning. Jämfört med automatiserade FV analyser som lider av kravet på dyra analysatorer och reagenser 5-7, FV mikroplattor analysreagensen och material är billiga och alla nödvändiga material kan inköpssed kommersiellt eller görs i egen regi. Manuell tilt-röret 3, 4 och automatiserade 5-7 FV analyser i allmänhet endast ge tiden för koagelbildning, inte tid, initial hastighet, och omfattningen av fibrin koagelbildning som alla noggrant uppmätt spektrofotometriskt med FV mikroplattan analysen. Slutligen, manuell tilt-rör 3,4 och automatiserad 5-7 FV analyser lider bara kunna mäta FV aktiviteten i plasmaprover en i taget, medan FV mikroplattan analysen är mottaglig för hög kapacitet och 12 prover kan vara analyserades samtidigt.
Mikroplattan analys användes för att visa att FV 9 DIC patientens plasma var mindre aktiv än i NHP grund av en kombination av fördröjda koagel och lägre initiala satser för koagelbildning i FV 1-enstegsanalys. De första andelen koagelbildning i FV 2-stegs-analys i DIC patienter plasma inte ändrats från NHP. De omfattning av koagelbildning i DIC patient plasma har inte heller ändrats från NHP i FV 1-stegs och 2-stegs-analyser. Minskad FV 1-stegs, 2-stegs och totala verksamhet kan ha berott på en ökad FV konsumtion 19 och / eller inaktivering 6 i enlighet med andra studier under patogenesen av detta förvärvade blodsjukdom. Med tanke på omfattningen av koagelbildning i plasma DIC var densamma som observeras med NHP, var denna variabel sannolikt ett resultat av fibrinogenkoncentrationen i FV-bristplasma och inte relaterad till egenskaperna hos patienten plasma.
Resultaten från mikroplattan analys visade att mätning av FV aktivitet i prover av human plasma kan erhållas från tiden och initiala hastigheten för koagelbildning från FV 1-enstegsanalys och tiden för koagelbildning och total aktivitet från FV 2 – enstegsanalys. Det var inte möjligt att erhålla kvantitativa mätningar av FV-aktivitet i ett plasmaprov baserad på omfattningen av koagelbildning i tHan FV 1 – och 2-stegs-analyser eller den initiala koagelbildning i FV 2-stegs-analys. Med tanke på alla reaktioner nådde ungefär samma grad av koagelbildning av 0,35 till 0,45 enheter mellan den initiala absorbansen före och den maximala absorbansen efter tromboplastin och kalciumklorid Dessutom ger mätning av omfattningen av koagelbildning inte en kvantitativ bedömning av FV aktivitet i en givet plasmaprov.
Den nya mikroplatta analysen finner användning i forskning och kliniska miljöer för mätning av FV aktivitet i prover av human plasma och fraktioner under dess rening från människor och djur plasma. Mikroplattan analysen kan användas för att mäta tiden, initial hastighet, och omfattningen av koagelbildning, parametrar allmänhet inte övervakas samtidigt i manuella tilt-rör analyser och automatiserade analysatorer koagulation. Denna information ger mer av en fullständig kvantitativ bedömning av engagemang FV under koagelbildning händelseni human plasma än har tidigare rapporterats 3-7. Denna information är särskilt viktigt i både forskning och kliniska laboratorier vid mätning betydande förändringar i FV aktivitet i prover av plasma eller med renat FV eller FVa. FV mikroplatta analysen kan också användas för att karakterisera och mäta föreningar som kan aktivera eller inaktivera FV och FVa, mäta FV aktivitet hos patienter med risk för ventrombos följd av FV Leiden-mutation 20, 21 och övervaka aktiviteten hos FV under dess rening från plasma.
FV mikroplatta analysen lätt kan anpassas för att mäta aktiviteten av en koagulationsfaktor i den yttre, inre, eller gemensamma vägen med hjälp av lämplig faktor-bristplasma och initiera reagens för fibrinbildning. Analysen kommer att öka vår förståelse av FV biokemi genom en mer korrekt och fullständig mätning av sin verksamhet i forskning och kliniska laboratorier. Ultimately, kommer denna information att påverka positivt vårdmiljöer genom tidigare diagnos och utveckling av mer effektiva behandlingar för personer som drabbats av koagulationsrubbningar såsom DIC.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen stöddes med Professionell utveckling och forskning Startup medel från University of Ontario Institute of Technology (UOIT) Dr John A. samer och en kanadensisk Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award till Irina Levit. Författarna erkänner Shannon Everett (Undervisning och lärande Centre UOIT) för hennes hjälp att förbereda videon. Författarna erkänner Dr Michael E. Nesheim (Institutionen för biokemi, Drottning universitetar, Kingston, ON) för hans mentorskap, insikt och hjälp diskussioner. Författarna erkänner också Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl Haemostasis and Thrombosis Center, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, Storbritannien) för att tillhandahålla de DIC patienten plasmor som används i studien.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
NaCl | Fisher | BP358-212 | |
Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |