De Moxi Z miniatuur automatische celgetalmeter is een nieuw instrument dat de Coulter principe combineert met gepatenteerde dunne-film-sensor-technologie en een eigen software algoritme om dimensionering uit te voeren en het tellen van een breed scala grootte van de deeltjes en aan de algehele gezondheid van monodisperse te bepalen zoogdiercellen culturen. Dit protocol beschrijft het gebruik van dit instrument voor het tellen en de beoordeling van de gezondheid van de celculturen.
Deeltjes en celtellingen wordt gebruikt voor diverse toepassingen, zoals routine celkweek, hematologische analyse en de industrie 1-5. Een kritische doorbraak in cel / deeltjestelling technieken was de ontwikkeling van de Coulter techniek Wallace Coulter dan 50 jaar geleden. De techniek houdt in de toepassing van een elektrisch veld over een microscopisch kleine opening en hydrodynamisch richten enkele deeltjes door de opening. De resulterende occlusie van de opening van de deeltjes levert een meetbare verandering in elektrische impedantie die direct en nauwkeurig worden gecorreleerd celgrootte / volume. De erkenning van de aanpak als de benchmark in cel / deeltjes te tellen komt voort uit de buitengewone precisie en nauwkeurigheid van de deeltjesgrootte en telt, in het bijzonder in vergelijking met handleiding en beeldvorming op basis technologieën (nauwkeurigheid in de orde van 98% voor Coulter tellers versus 75 – 80% voor manuele en visie-gebaseerde systemen). Dezekan worden toegeschreven aan het feit dat, in tegenstelling tot de beeldvorming benaderingen naar cel tellen, de Coulter Techniek een echte drie-dimensionale (3-D) het meten van cellen / deeltjes die aanzienlijk aantal storingen teruggebracht van puin en clustering maakt door het berekenen van nauwkeurige volumetrische informatie over de cellen / deeltjes. Algemeen is dit een middel voor het opsommen van de dimensionering en cellen in een nauwkeuriger, minder vervelend, minder tijdrovend en minder subjectieve wijze dan andere tel technieken 6.
Ondanks de bekendheid van de Coulter techniek in cel tellen, is het wijdverbreide gebruik in de dagelijkse biologische studies zijn onbetaalbaar vanwege de kosten en de grootte van traditionele instrumenten. Hoewel een goedkopere Coulter gebaseerd instrument is geproduceerd, heeft beperkingen ten opzichte van de duurdere tegenhangers in de correctie "toeval gebeurtenissen" waarin twee of meer cellen door het diafragma en gelijktijdig gemeten. Another beperking met bestaande technologieën Coulter is het gebrek aan statistieken over de algemene gezondheid van de cel monsters. Bijgevolg moet aanvullende technieken vaak gebruikt in combinatie met Coulter tellen levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Dit strekt zich uit experimentele setup-tijd en kosten, omdat de traditionele methoden van de levensvatbaarheid beoordeling nodig cel kleuring en / of het gebruik van dure en zware apparatuur zoals een flowcytometer.
De Moxi Z mini geautomatiseerde cel teller, hier beschreven, is een ultra-kleine tafelmodel instrument dat de nauwkeurigheid van de Coulter Principe combineert met een dunne-film-sensor-technologie in staat te stellen precieze maatvoering en het tellen van deeltjes, variërend 3 tot 25 micron, afhankelijk van de celtellingen de cassette gebruikt. De M type cassette kan worden deeltjes tellen van de gemiddelde diameter van 4-25 micron (dynamisch bereik 2-34 micron), het type S cassette kan worden deeltjes met en gemiddelde diameter van 3 tellen – 20 micron (dynamische range 2-26 micron). Aangezien het systeem een volumetrische meetmethode de 4-25 micron overeen met een celvolume reeks van 34 – 8180 fL en 3 – 20 micron overeen met een cel volume-gebied van 14 tot 4200 fL, welke relevant is voor de niet-bolvormige deeltjes worden gemeten. Van zoogdieren celtellingen met de Moxi Z uitvoert, worden de cellen geteld eerst verdund met ORFLO of dergelijke verdunningsmiddel. Een cel tellen cassette is geplaatst in het instrument, en het monster is geladen in de haven van de cassette. Duizenden cellen worden getrokken, enkele bestand via een "Cell Sensing Zone" (CSZ) in de dunnefilm membraan over 8-15 seconden. Na de run het instrument gebruikt eigen curve-fitting in combinatie met een eigen software algoritme toeval geval correctie voorzien met een evaluatie van de algemene gezondheid cultuur door bepaling van de verhouding van het aantal cellen in de populatie van belang het aantal deeltjes. Het totale aantal deeltjes Met inbegripe gekrompen en afgebroken dode cellen, evenals andere vuil en verontreinigingen. De resultaten zijn weergegeven in histogram formaat met een automatische curvefit met poorten die handmatig kan worden bijgesteld te worden.
Uiteindelijk is de Moxi Z kan tellen met een precisie en nauwkeurigheid te vergelijken met een Coulter Z2, de huidige gouden standaard, terwijl ze bijkomend kunst gezondheid informatie. Verder realiseert deze resultaten in minder tijd, met een kleinere footprint, met aanzienlijk eenvoudiger bediening en onderhoud, en tegen een fractie van de kosten van vergelijkbare technologieën.
De onderliggende uitvoering van de Coulter aanpak kan zeer deterministisch van de algehele nauwkeurigheid van de metingen. Een kritische gebied is de correctie van de ruwe-cel-tellingen voor "toeval events" waar twee of meer cellen tegelijk door het diafragma en worden gemeten als een elektrische gebeurtenis. "Toeval gebeurtenissen" bijdragen tot fouten die varieert afhankelijk van een aantal factoren, waaronder celgrootte en mate van bundeling (Davis et al. 1967) 6. Hierdoor kan de vereiste toeval correctie voor elk monster niet worden voorspeld zeer verschillende tussen cellen / deeltje typen en ook verschillende culturen identieke celtypen. Gevestigde theorie, verankerd in de eerste publicaties Coulter, omvat de toepassing van een logaritmische aanpassing van de ruwe tellingen gebaseerd op het aantal waargenomen en aan een empirisch bepaalde, deeltjes-specifieke correctiefactor z. Hoewel nauwkeurige tellingen kan worden bereikt met tzijn correctie-algoritme wordt beperkt de praktische toepassing vanwege de grote variaties in z waarden tussen celtypes en de overeenkomstige moeilijk nauwkeurig te voorspellen zijn waarde. Hier de "echte" cellen die de Moxi Z curve fitting in combinatie met het samenvallen correctie-algoritme de Moxi Z corrigeert voor dynamisch toeval de werkelijke concentratie te bereiken. In vergelijking met de resultaten verkregen met hoogwaardige Coulter Z2 de Moxi Z geproduceerd vergelijkbare aantallen in een concentratie van 0 – 500.000 cellen / ml (type M cassette) en 3000 – 2 2.5e 6 cellen / ml (Type S cassette) . Bovendien is de Moxi Z bereikt deze telling nauwkeurigheid een soortgelijke lage variatiecoëfficiënt in counts en nauwkeurigheid in deeltjesgrootte die kenmerkend is voor de gouden standaard Coulter-techniek celtellingen.
Bovendien is de hier gepresenteerde gegevens blijkt dat de Moxi Z kan waardevolle informatieten aanzien van de algehele gezondheid van de celculturen. De Moxi Z maakt gebruik van de curve fitting aanpak met een eigen software algoritme om deze cultuur van medische controle te bepalen. Morfologische veranderingen in verband met celdood, zoals blebbing, breken en volumetrische vervalsing (Kataoka en Tsuruo 1996 Liegler et al. 1995, Sheridan et al. 1981) 12-14, maken het mogelijk de Moxi-Z impedimetrische verschillen onderscheiden leven populaties en dode cellen / puin populaties. De MVI wordt gegenereerd door analyse van de cultuur / deeltjesgrootteverdeling de relatieve bijdragen van de deeltjes vuil, gekrompen necrotische cellen en de curve uitgerust celpopulatie van interesse. De MVI waarde geeft daardoor een populatie index of ratiometrische maat voor de monodisperse populatie telt ten opzichte van de totale deeltjes populatie profiel. Deze waarde is dan algoritmisch-aangepast op basis van bevolkingsstatistieken en empirische waarnemingen. Because de MVI kijkt naar andere parameters dan de traditionele benaderingen vlekken, is het niet te verwachten dat deze technieken spiegel, maar in plaats daarvan is een waardevol alternatief blik in de gezondheid van een cel cultuur, met name met betrekking tot het puin en microbiële verontreinigingen.
Kortom, de Moxi-Z celgetalmeter is een ultra klein tafelmodel instrument dat een nauwkeurige en reproduceerbare testen van het aantal cellen, celgrootte, en de gezondheid van de cellen met behulp van de Coulter Principe en curve-fitting software-algoritmen in combinatie met een gepatenteerde dunne-film-sensor-technologie biedt . Met type M cassette is kan het tellen van deeltjes varieert 4-25 micron (dynamisch bereik van 2-34 micron) in 8 seconden. Met cassette het type S is kan het tellen van deeltjes varieert van 3 – 20 micron in diameter (dynamisch bereik van 2-26 micron) in 15 seconden. Bovendien is de Moxi-Z voert Keuringen zonder gebruik van de reagentia. Het is veel minder arbeidsintensief intensive en subjectieve dan handmatig tellen. In vergelijking met standaard Coulter tellen, de Moxi sneller aanmerkelijk kleiner, levert informatie, aanzienlijk minder onderhoud gemakkelijker te gebruiken, en een fractie van de kosten.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ORFLO Diluent | ORFLO | MXA006 | |
Cassette Dispenser | ORFLO | Stores up to 25 cassettes for convenient dispensing | |
USB Cable | ORFLO | Connects instrument to PC/Mac or power adapter | |
Power Adapter (US and EU models only) | ORFLO | Connects USB cable to an AC outlet | |
USB Flash Drive | ORFLO | Stores Moxi Z software and user manual | |
Calibration Check Beads | ORFLO | ||
Electronic Calibration Cassette | ORFLO | Electronic cassette for verifying proper system operation and calibration |