Summary
En steg för steg-protokollet för att isolera och identifiera RNA tillhörande komplex genom RIP-Chip.
Abstract
Som en följd av utvecklingen av hög genomströmning sekvensering och effektiv microarray analys har den globala genuttrycksanalys bli ett enkelt och lättillgängligt form av datainsamling. I många forskning och modeller sjukdom emellertid inte steady state-nivåer av målgen-mRNA inte alltid direkt korrelerar med steady-state protein. Posttranskriptionell genreglering är en trolig förklaring till skillnaden mellan de två. Driven av bindningen av RNA-bindande proteiner (RBP), påverkar post-transkriptionell reglering mRNA-lokalisering, stabilitet och översättning genom att bilda en ribonukleoprotein (RNP)-komplex med mål-mRNA. Identifiera dessa okända de novo mRNA mål från cellulära extrakt i RNP komplexet är avgörande för att förstå mekanismer och funktioner hos RBP och deras resulterande effekt på protein utgång. Detta protokoll beskriver en metod kallad RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), som gör det möjligt att identifiera särskilda mRNA associerade i ribonukleoprotein komplexa, under föränderliga experimentella betingelser, tillsammans med alternativ för att ytterligare optimera ett experiment för den enskilde forskaren. Med detta viktiga experimentella verktyg kan forskarna undersöka de intrikata mekanismer associerade med posttranskriptionell genreglering samt andra interaktioner ribonukleoprotein.
Protocol
Experiment förberedelse
Innan du börjar experimentera, är det viktigt att ha alla reagenser, containrar och redskap RNas gratis. Behandla glasvaror med RNas-inhibitor (RNaseZAP, Ambion) följt av sköljning med DEPC-behandlat vatten. Se till att alla reagenser bekräftats som RNas gratis.
1. Förbered mRNP Lysate
- Odla och skörda exponentiellt växande vävnadsceller att producera mellan 2-5 mg totalt protein för varje RIP.
- Två P150 odlingsskålar räcker vanligtvis.
- För varje RBP utreds måste totala cellulära nummer och protein uppgår optimeras för att maximera lämpligt mål-mRNA och samspel RBP.
- RIP för QRT-PCR-analys kan kräva mindre cellulär lysat (ca 400 g totalt protein) på grund av dess förstärkning och detektionsmetod speciellt för hög förekomst RBP-anordningama som Hur, AUF1, TIAR.
- Pelletera celler via centrifugering vid 200 x g under 8-10 min vid 4 ° C, tvätta därefter tre gånger med iskall PBS.
- Efter slutlig tvätt, knacka försiktigt på botten av röret och resuspendera cellpelleten i lika volymer av beredd polysom lysbuffert (PLB) med RNas och proteashämmare.
- Det rekommenderas att mäta ut den exakta volymen av cellpellet.
- Försiktigt pipett blandning (inte vortex) för att bryta sönder klumpar av celler och inkubera lysatet på is i 5 min.
- Centrifugera vid 13.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C för att rensa lysatet av skräp.
- Överför omedelbart raderas supernatanten i förväg kyld mikrofugrör.
- Håll på is och förvara vid -80 ° C.
- Omedelbar frysning fullbordar korrekt lys av cellerna och förhindrar oönskad bindning. Fortsätt med RIP omedelbart efter prov tina och hålla prover på is för att undvika RNA-nedbrytning. </ Li>
- Denna lysat kan lagras i upp till sex månader vid -80 ° C. Undvik upprepade cykler frysning upptining eftersom detta kan leda till protein och / eller mRNA-nedbrytning.
- Kvantifiera proteinkoncentration i lysat med användning av standard Bradford proteinanalys.
2. Coat Protein A Sepharose pärlor med antikropp och Wash
- Pre-vågor protein A Sepharose (PAS) pärlor över natten i NT2 buffert (3-4 volymer) med 5% BSA. Förvaras vid 4 ° C.
- Långtidslagring av upp till flera månader vid 4 ° C är möjlig när kompletterat med 0,1% natriumazid.
- Protein Sepharose kulor bör väljas utifrån isotyp av mål RBP antikropp. Proteiner A, G och A / G alla har specifika isotyp mål och varierar i mål affinitet. Protein A Sepharose-pärlor användes baserat på isotyp specificitet och affinitet för Hur proteinantikropp.
- Före användning, avlägsna överskott NT2 buffert, såatt de slutliga pärlor till buffert är 1:1.
- Använda 1,5 ml RNas-fri mikrocentrifugrör, avlägsna 100 pl av PAS uppslamning och tillsätt 30 | ig av antikropp för varje enskild IP-reaktion (dvs specifik RBP och isotypkontroll).
- Lägg 100-200 pl av NT2 buffert till antikropp pärla blandning.
- Blandning kan lagras under flera veckor vid 4 ° C när kompletterad med 0,1% natriumazid.
- En isotypmatchad antikropp eller helt normala sera från samma arter bör användas parallellt såsom en antikropp kontroll mot bakgrund-RNA.
- Lägg lämplig antikropp till pärla blanda och inkubera över natten, tumlande ände över ände vid 4 ° C.
- Optimera antikroppstiter för specifikt protein som undersöks (1, 5, 10 eller 30 ng av antikropp är vanligen tillräcklig).
- Förbered antikroppsbelagda pärlorna omedelbart före användning genom tvättning med 1 mliskall NT2 buffert 5 gånger.
- Tvätta pärla blandning genom centrifugering vid 13.000 x g under 1-2 minuter vid 4 ° C.
- Ta försiktigt bort den maximala mängden supernantant med handen pipett eller aspirator men var noga med att inte störa pelleten.
- Tvätt hjälper till att avlägsna obunden antikropp och RNas föroreningar från antikroppar blandning.
- När den slutliga tvätten har fullbordats, resuspendera kulorna i 700 | il iskall NT2 buffert följt av behandling med olika RNas-inhibitorer att skydda mål mRNA, inklusive 10 pl RNas Ut vid 40 U / ^, 10 ^ il av 100 mM DTT och 15 pl EDTA (15 mM). Bringa volymen till 1.000 pl med buffert NT2.
- Vanadyl ribonukleosid komplex används inte på grund av hämmande effekt av EDTA.
3. Immunutfällning och RNA Nederbörd
- Valfri preclearn steget:
- För att minska bakgrunden, kan pärlor och kontroll antikropp kan användas för att pre-klara lysat. Detta kan minska signalen i utmatningen.
- Detta steg kan vara nödvändigt att minska bakgrunden när du gör IP-följt av microarray. Det är i allmänhet inte nödvändigt för IP följt av QRT-PCR.
- Preclear med 15 pg av isotyp kontroll under 30 min / 4 ° C tumlande ände över ände.
- Lägg 50 il försvälld PAS pärlor icke belagda med antikropp från steg 2,1.
- Inkubera 30 min / 4 ° C med rotation ände över ände
- Centrifugera vid 10.000 x g vid 4 ° C. Spara supernatanten för IP.
- Tillsätt 100 | il av isolerade klarnat lysat (ca 2-5 mg) berett antikropp blanda.
- Späda lysat kommer att bidra till att minska bakgrund och icke-specifik bindning.
- Mängd lysat ingång kan variera beroende på detektionsmetod och överflöd av RBP oR effektivitet RBP antikropp noterats i steg 1.1.c.
- (Valfritt) omedelbart blanda röret genom att försiktigt vicka flera gånger följt av kort centrifugering vid 10.000 x g vid 4 ° C för att pelletera pärlorna och omedelbart avlägsna 100 pl av supernatanten som en total ingång mRNA representation för qPCR analys med användning av standard-RNA isoleringstekniker.
- Detta steg är att bekräfta att ingående lysat-RNA är optimal för IP och bör endast utföras som en kontroll steg eller som ett felsökningssteg efter RIP med dålig RNA resultat.
- Wrap röret i parafilm för att säkerställa tätning och inkubera vid 4 ° C under 2 till 4 timmar, tumlande ände över ände.
- Timing på inkubation bör optimeras utifrån mål överflöd och bör minimeras för att undvika komplexa omlagring eller nedbrytning. För vissa RBP-anordningama kortare inkubationer kan vara mer optimalt.
- Pelletsbrännare pärlor på 5.000 XGFeller 5 minuter vid 4 ° C och spara supernatanten för eventuell analys med Western blöt. Förvara alikvoter vid -80 ° C.
- Alikvoter av supernatanten med höga mängder av kvarvarande målprotein kan indikera ett fel av det protein som skall utfällas genom Sepharose-pärlor.
- Såsom beskrivits tidigare, tvätta pärlor 5 gånger med 1 ml iskall buffert NT2 och centrifugering (5.000 x g under 5 minuter vid 4 ° C) och sedan avlägsna supernatanten med handen pipett eller en aspirator.
- Mer stringenta tvättbetingelser metoder kan användas för att minska bakgrunden genom att komplettera NT2 buffert med natriumdeoxicholat, urea eller SDS.
- Håll prover på is så mycket som möjligt och arbeta snabbt för att minimera nedbrytning av mål-mRNA.
- Valfritt: Spara en liten alikvot (10%) av pärla blandningen eller köra ytterligare ett prov parallellt för att kontrollera IP effektivitet målprotein med användning av Western blot-analys.
4. DNas och proteinas K Behandlingar
- Efter tvättning, återsuspendera pärlorna med 100 pl av NT2-buffert kompletterad med 5 ul RNas-fritt DNas 1 (2 U / ^ il).
- Håll vid 37 ° C under 5-10 min. Tillsätt 1 ml av NT2-buffert och centrifugera vid 5.000 x g under 1 min vid rumstemperatur.
- En liten (~ 10%) alikvot av pärlor kan användas för att kontrollera IP effektivitet genom SDS-PAGE-analys.
- Återsuspendera PAS pelleten i 100 | il buffert NT2, 5 pl proteinas K (10 mg / ml), och 1 pl 10% SDS.
- Inkubera återsuspenderade pärlblandningen under 30 minuter vid 55 ° C i ett vattenbad, försiktigt snärta vid varje 10 minut.
- Proteinas K kommer stöd i frisättningen av RNP komponenterna.
- Pellet pärlor vid 5.000 x g under 5 min vid rumstemperatur (RT) och samla upp supernatanten (~ 100 | il).
- Tillsätt 200 | il NT2 buffert till pärlor, centrifuFuge 5.000 x g under 2 minuter vid RT, samla supernatanten (~ 200 | il), och pärlor kastas överbord.
- Kombinera supernatanter (100 pl och 200 pl) och tillsätt 300 pl undre skikt av syra fenol-CHCl 3.
- Vortex, 1 min Rt (eller 37 ° C i skakanordning) och centrifugera vid 16.000 xg vid rumstemperatur under 1 min.
- Samla 250 ul övre skikt (INTE störa gränssnitt), tillsätt 25 ul natriumacetat vid pH 5,2, 625 ul 100% EtOH och 5 pl glycoblue och blanda väl.
- Lagra över natten vid -20 ° C.
- För att säkerställa korrekt återvinning av RNA, kommer tillsatsen av glycoblue öka synligheten av RNA pelleten genom att fungera som en bärarmolekyl.
- Följande dag, blanda rör med inversion 3-5 gånger, snurra på 12.000 xg vid 4 ° C i 30 minuter och kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml av 70% EtOH till blå pelleten och blanda genom inversion eller virvling.
- Centrifugera 12.000 xg vid 4 ° C under 2 minuter.
- Discard supernatanten och centrifugera 12.000 xg i 1 min vid 4 ° C.
- Avlägsna eventuellt kvarvarande 70% EtOH med en pipett och lufttorka pellet vid RT under 5 minuter.
- Återsuspendera i 20-40 ul RNas / DNas-fritt vatten eller annan lämplig volym som behövs.
- Prov är nu redo för ytterligare nedströms applikationer såsom QRT-PCR eller microarray.
- NanoDrop spektrofotometri kan användas för att bedöma provkoncentration, men med dyrbara prover, kan det vara fördelaktigt att undvika nanodropping prover som det kan vara slösaktig och relativt felaktiga. Vi föreslår normaliserande prover till transkript housekeeping-gen för att utvärdera renhet och IP-effektivitet för ädelstenar eller låg avkastning prover.
5. Representativa resultat
Om förfarandet är optimerad och utförs korrekt, bör immunoprecipitation ge betydande anrikning av mRNA mål. Vanligtvis, Beroende på RBP och dess mRNA-mål (er), ser vi anrikning av ungefär 10 - till 50-faldigt vid bedömning av QRT-PCR. Många mål RBP-anordningama kan upptäckas en masse med microarray analys. Emellertid är denna metod mer känslig för nedbrytning i jämförelse med QRT-PCR. Beroende på RBP, antalet mål och effektiviteten av reaktionen kan microarray avslöja hundratals nya mål, eller det kan bara avslöja en få, om några. Till exempel, en av de bättre karakteriseras RNA-bindande proteiner Hur, efter transkriptionellt reglerar expressionen och translationen av många viktiga fysiologiska gener 1, 2. Isolering av Hur-ribonucleo-komplexet via RIP-Chip i bröstcancercellinjer, till exempel, visade anrikning av flera kända viktiga HUR mål, inklusive β-aktin med QRT-PCR såsom visas i figur 1. I båda cancercellinjer β-aktin är anrikad 12 - till 15-faldigt. Vanligtvis när de utförs på rätt sätt ser vi en betydande Enrichment av β-aktin i olika cellinjer. Men om RIP inte avslöjar någon större vinst för β-aktin indikerar detta ett problem med översynsperioden och förfarandet kan behöva upprepas. Dessutom visade microarray analys av immunprecipiterade prover från dessa cellinjer distinkta uttryck undergrupper Hurs mål i olika östrogenreceptor (ER) positiv MCF-7-cancerceller jämfört ER negativa MB-231 bröstcancercellinjer som visas i figur 2 1. Dessa mål faller i flera kategorier: kända och okända HUR mål som antingen var förknippade eller inte i samband med cancer. Till exempel CALM2 och CD9 båda cancer gener som inte tidigare identifierats som HUR mål. Använda microarray och bekräftar med QRT-PCR, CALM2 och CD9 befanns vara 5 - till 180-faldigt anrikat i HUR pelleten indikerar en framträdande interaktion mellan HUR proteinet och dessa gener mål.
Figur 1. Immunutfällning och RIP i MB-231 (ER-) och MCF-7 (ER +) bröstcancerceller. Immunfällningar utfördes från MB-231 eller MCF-7-cell-lysat med användning av anti-Hur monoklonal antikropp (3A2) och lgG1 isotypkontroll. A. IP Västra Hurs avslöjade förväntad storlek band som detekteras av 3A2. Panelen på höger avslöjar mängder HUR i indata lysat används från båda cellinjer, med β-tubulin som en belastning kontroll. B. Kontroll av kvantitativ RT-PCR visade femton-och elva-faldig anrikningar av β-aktin, en känd HUR mål i de 3A2 IP från MB-231 och MCF-7, respektive. Samtliga ΔΔCT värden normaliserades till GAPDH. Experiment utfördes i duplikat (n = 2).
Figur 2. HUR RIP-CHIP identifierar olika genetiska profiler i ER + och ER-bröstcancerceller.HUR immunoprecipitationer utfördes från MB-231 eller MCF-7-cellysat med HUR antikropp och IgG1 isotypkontroll hybridiserade till Illumina Sentrix arrayer (47.000 gener). Styrsignaler subtraherades. Resultat representerar kumulativa data från 12 olika matriser. Experiment utfördes i tre exemplar (n = 3) för varje cellinje med matchande kontroller. Vågar är log2.
Discussion
På grund av att denna typ av experiment, optimering och erfarenhet kommer att vara de enda garanterade sätt att framgångsrikt förvärva de avsedda resultaten. I många steg i detta förfarande, temperatur och effektiv hantering av reagens och produkter är kritiskt viktiga. Ordentlig planering och genomförande av teknik kommer att bidra till att säkerställa att experimentet utfördes i en lämplig tidsram på de rekommenderade optimala temperaturer. En viktig fråga med RNA-isolering experiment är känsligheten hos RNA för nedbrytning av RNaser. Alla reagens måste vara RNas fri och lagras eller används i RNas-fria behållare. Detta är ett kritiskt steg för att säkerställa integriteten av din mRNA prov. Även när experimentet utförs korrekt, kan dock det önskade resultatet inte uppnås på grund av typen av interaktionen mellan RBP och dess mRNA mål.
Ett potentiellt problem är att ha låga eller ingen signal från RNA isolerades genom RIP-Chip.Även om det kan finnas signal från totalt RNA, kan detta vara ett resultat av otillräcklig bindande protein dras ned av pärlorna. Det första steget är att bekräfta att den cellulära lysatet som används har tillräcklig uttryck för specifika RBP. Efter bekräftelse, kan proteinet isoleras efter den slutliga tvättningen NT2 och återsuspenderades i Laemmli-buffert eller annat lämpligt denaturerande buffert och värmdes vid 95 ° C under 5 minuter. Western blot-analys kan användas på dessa prover i samarbete med indata lysat samt negativa kontroller för att säkerställa tillräcklig dra ner på tillhörande protein.
På grund lysering cellen krävs för att komma dessa komponenter, kan risken för onormala och oönskade interaktioner mellan normalt separerade proteiner och mRNA införas. Dessa interaktioner kan eventuellt binda och "suga upp" din målgrupp mRNA eller bindande proteiner genom ospecifika interaktioner. Dessutom proteiner i dessa varierande samarbetenditions kan vika i flera varianter och deras bindande motiv kan bli otillgängliga för sina mål mRNA, förebygga deras interaktioner. Båda dessa stärka vikten av att arbeta effektivt och att utnyttja de optimala temperaturerna anges för att begränsa dessa oönskade interaktioner. Dessutom kommer optimering av tvättbetingelser för varje specifikt målprotein vara kritisk för att maximera renheten av interaktionen. Mer stringenta tvättbetingelser kan behövas. Exempelvis kan tvättbufferten kompletteras med SDS eller en lämplig mängd urea för att minska ospecifika interaktioner och bakgrund i signalutmatning. Detta kommer att vara helt beroende av försöksledaren mål RBP samt mål-mRNA i de unika fysiologiska betingelser. Vissa villkor kommer inte att vara lämpliga för vissa verktyg mRNA analys, som bör observeras vid framställning av proverna.
Slutligen, även om RIP är framgångsrik i anrikning av RNA-RBP interaktioner en välkänd emission med RIP (CHIP) metod är oförmågan att identifiera de specifika domänerna av RBP på övergående mRNA mål. Flera tvärbindande tekniker kan användas, följt av RIP att isolera unika sekvenser mål, men tenderar användningen av kortvågigt UV att leda till nukleinsyra skador. En ny metod som kallas PAR-klipp eller fotoaktiverbara ribonukleosid tvärbindning och immuoprecipitation sysselsätter långvågig UV att införliva tiouridin i begynnande RNA möjliggör identifiering av unika bindningsställen från både stabila och övergående RNA interaktioner.
Sammantaget har RIP-Chip etablerats som ett utmärkt verktyg som används för att isolera och studera samspelet mellan RNA-bindande proteiner och deras mål mRNA av vår grupp, liksom många andra forskargrupper. Även känslig karaktär och praktiken kommer korrekt genomförande av detta förfarande ger isolering av dessa RNP komplex, som tills nyligen, har varit inaccessible för Discovery och analys.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Department of Defense (Idea Award W81XWH-07-0406) - Till Ulus Atasoy
NIH RO1 A1080870 - Till Ulus Atasoy
NIH R21 A1079341 - Till Ulus Atasoy
University of Missouri institutionella fonder - Till Ulus Atasoy
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
| DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
| Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
| Glycogen | Ambion | 9516 | |
| 1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
| Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
| 1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
| 1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| NT2 Buffer | *See Below | ||
| Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
| Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
| 1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
| 1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
| Reagent Workup | |||
| Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware | |||
| Polysome lysis Buffer | |||
| 100 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 10 mM HEPES (pH 7.0) | |||
| 0.5% NP40 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 100 units/ml RNase Out | |||
| 400 μM VRC | |||
| Protease inhibitor cocktail tablet | |||
| 5 ml of Polysome lysis buffer | |||
| Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) | |||
| 500 μl of 1 M KCL | |||
| 25 μl of 1 M MgCl2 | |||
| 25 μl of NP40 | |||
| 4.7 ml RNase-DNase-free H2O | |||
| 50 μl of 1 M DTT | |||
| 12.5 μl of 100 U/ml RNase Out | |||
| 200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) | |||
| 10 μl 200 mM VRC (at time of use) | |||
| NT2 Buffer | |||
| 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 1 mM MgCl2 | |||
| 0.05% NP40 | |||
| 1 L of NT2 Buffer | |||
| 50 ml Tris (pH 7.4) | |||
| 30 ml 5 M NaCl | |||
| 1 ml 1 M MgCl2 | |||
| 500 μl NP40 | |||
| 820 ml RNase-DNase-free H2O |
References
- Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).
- Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).
- Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays. Methods. 26, 191-198 (2002).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera. Gene. 317, 79-87 (2003).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).
- Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A.
- de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).
- de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. HuR: post-transcriptional paths to malignancy. RNA Biol. 2, 11-13 (2005).
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors. Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).
- Hieronymus, H., Silver, P. A. Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery. Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).
- Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export. Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).
- Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability. Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).
