Este é um método rápido e abrangente de imunofenotipagem mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) e enriquecendo Gr-1<sup> +</sup> Leucócitos a partir de baços de rato. Este método utiliza a citometria de fluxo e Cell AutoMACS classificação para enriquecer para viável Gr-1<sup> +</sup> Leucócitos anteriores FACS de triagem de MDSC para uso<em> In vivo</em> E<em> In vitro</em> Ensaios.
MDSC são uma população heterogénea de macrófagos, células dendríticas imaturas e granulócitos que se acumulam nos órgãos linfóides em condições patológicas, incluindo infecção por parasitas, inflamação, stress traumático, enxerto-versus-hospedeiro da doença, a diabetes eo cancro 1-7. Em ratinhos, MDSC expressa Mac-1 (CD11b) e Gr-1 (Ly6G e Ly6C) antigénios de superfície 7. É importante notar que MDSC são bem estudada em vários hospedeiros portadores de tumor, onde são significativamente expandidas e suprimir anti-tumorais respostas imunes homólogos em comparação com naive 7-10. No entanto, dependendo do estado patológico, existem diferentes subpopulações de MDSC com mecanismos distintos e alvos de supressão 11,12. Assim, os métodos eficazes para isolar populações viáveis MDSC são importantes na elucidação suas diferentes mecanismos moleculares de supressão in vitro e in vivo.
Recentemente, o Ghansah grupo relatou a expansão do MDSC num modelo murino de pâncreas cancro. O nosso portadores de tumor MDSC exibir uma perda de homeostase e aumento da função supressora em comparação com MDSC ingénuos 13. Percentagens MDSC são significativamente menos nos compartimentos linfóides de camundongos normais vs tumor-rolamento. Esta é uma ressalva importante, que muitas vezes dificulta precisas análises comparativas destes MDSC. Portanto, enriquecendo Gr-1 + leucócitos de camundongos ingênuos antes de separação de células activadas por fluorescência (FACS) fortalece a viabilidade, pureza e reduz significativamente o tempo de classificação. Todavia, o enriquecimento de Gr-1 + leucócitos de camundongos portadores de tumor é opcional uma vez que estes estão em abundância para FACS rápidas de classificação. Portanto, neste protocolo, nós descrevemos um método altamente eficiente de imunofenotipagem MDSC e enriquecendo Gr-1 + leucócitos de baços de camundongos normais para classificar MDSC em tempo hábil. Camundongos imunocompetentes C57BL / 6 são inoculadas com murino Panc02 cells subcutânea enquanto camundongos ingênuos receber 1XPBS. Aproximadamente 30 dias após a inoculação; baços são removidos e processados em suspensões de célula única, utilizando uma célula de dissociação peneira. Os esplenócitos são então glóbulo vermelho (RBC) lisadas e uma alíquota destes leucócitos são coradas usando fluorocromo-anticorpos contra Mac-1 e Gr-1 a percentagens imunofenotipo MDSC utilizando citometria de fluxo. Numa experiência paralela, os leucócitos inteiras a partir de ratinhos naive são coradas com fluorescência conjugados Gr-1, incubados com anticorpos PE-micropérolas e positivamente seleccionadas utilizando uma separação de células automatizado Magnética Activado (autoMACS) Pro Separator. Em seguida, uma alíquota de Gr-1 + leucócitos são coradas com Mac-1 anticorpos para identificar o aumento em percentagem MDSC utilizando citometria de fluxo. Agora, estas GR1 leucócitos + enriquecidos estão prontos para a selecção de FACS MDSC para ser usado em análises comparativas (ingénuo vs portadores de tumor) em in vivo e in vitro </in> ensaios.
Este é um método detalhado para o processamento e immunophentyping populações MDSC que é aplicável a diferentes tecidos linfóides a partir de vários modelos animais. Em particular, o enriquecimento autoMACS pode ser usado para o isolamento de várias populações de leucócitos, incluindo Gr-1 depleção de esplenócitos 4, a purificação de subconjuntos mielóides de esplenócitos e gânglios linfáticos 5, o isolamento dos neutrófilos da medula óssea de 14 e purificação de…
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos o fluxo USF Facilidade Núcleo Citometria. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Denise Cooper para a partilha de recursos. Gostaríamos também de agradecer a Maya Cohen, Laura Pendleton e Diana Latour por sua assistência na criação e filmagens deste vídeo. NN suportado pela NSF FG-LSAMP Ponte para o Doutorado Fellowship HRD # 0929435. Este trabalho foi financiado pela Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional # 93-032-13/Moffitt Cancer Center, atribuído ao TG.
REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |