Bu myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) işaretleyicidir ve Gr-1 zenginleştirmek için hızlı ve kapsamlı bir yöntemdir<sup> +</supFare dalak gelen> lökositlerin. Bu yöntem uygulanabilir Gr-1 için zenginleştirmek için sıralama akım sitometri ve AutoMACS Hücre kullanır<sup> +</supKullanım için MDSC sıralama FACS önce> lökositlerin<em> In vivo</em> Ve<em> In vitro</em> Deneyleri.
MDSC olgunlaşmamış makrofajlar, dendritik hücreler ve paraziter enfeksiyon, inflamasyon, travmatik stres, Graft-versus-host hastalığı, diyabet ve kanser de dahil olmak üzere 1-7 patolojik durumlarda lenfoid organlarda birikir granülosit heterojen bir nüfus vardır. Farelerde, MDSC ekspres Mac-1 (CD11b) ve Gr-1 (Ly6G ve Ly6C) yüzey antijeni 7. Bu MDSC de önemli ölçüde genişletilmiş, çeşitli tümör taşıyan konaklar incelenmektedir dikkat ve 7-10 naif muadillerine göre anti-tümör immün yanıtı bastırmak için önemlidir. Ancak, patolojik durumuna bağlı olarak, bastırma 11,12 ile farklı mekanizmaları ve hedefleri ile MDSC farklı alt nüfusları vardır. Bu nedenle, canlı MDSC popülasyonlarının etkin bir yöntem izole etmek için in vitro ve in vivo bastırma onların farklı moleküler mekanizmalar durulaştırmada önemlidir.
Son zamanlarda, Ghansah grubu, bir mürin pankreas kanseri modelinde MDSC genişlemesi rapor etmiştir. Bizim tümör taşıyan MDSC homeostazının kaybı görüntülemek ve naif MDSC 13 oranla baskılayıcı fonksiyonu artmıştır. MDSC yüzdeleri naif vs tümörü taşıyan farelerin lenf bölümlerinde önemli ölçüde azdır. Bu genellikle bu MDSC doğru karşılaştırmalı analizleri engellemektedir büyük bir uyarı vardır. Bu nedenle, önceden Floresans Aktif Hücre Sıralama (FACS) kadar naif farelerden Gr-1 + lökositleri zenginleştiren saflık, canlılığı artırır ve önemli ölçüde sıralama zamanı azaltır. Bu sıralama hızlı FACS için bolca bulunur Ancak, tümör taşıyan farelerin Gr-1 + lökositlerin zenginleştirme isteğe bağlıdır. Bu nedenle, bu protokol, biz MDSC işaretleyicidir ve zamanında MDSC sıralama için naif farelerin dalak gelen Gr-1 + lökositleri zenginleştiren son derece etkili bir yöntem tarif. İmmünokompetent C57BL / 6 fare mürin Panc02 ce ile inoküle edilmiştirLLS subkutan naif fareler 1XPBS alırsınız oysa. Yaklaşık 30 gün aşılama sonrası; dalak hücre ayrışma elek kullanarak tek hücre süspansiyonları içine hasat ve işlenir. Splenositlerin sonra Eritrosit (RBC) parçalanır ve bu lökositlerin bir kısım Akım Sitometri kullanarak immünfenotip MDSC yüzdeleri Mac-1 ve Gr-1 karşı florokrom-konjuge antikor kullanılarak boyandı edilir. Paralel bir deneyde, naif farelerin tüm lökositlerin otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (autoMACS) Pro Separator kullanarak PE-mikro inkübe ve olumlu seçilen floresan konjuge Gr-1 antikorları ile boyanan. Sonra, Gr-1 + lökositlerin bir kısım Akım Sitometri kullanarak MDSC oranlarda artış tanımlamak için Mac-1 antikorları ile boyanan. Şimdi, bu Gr1 + zenginleştirilmiş lökositler in vivo ve in vitro (naif vs tümör taşıyan) karşılaştırmalı analizlerde kullanılmak üzere MDSC sıralama FACS hazır </em> deneyleri.
Bu, çeşitli hayvan modellerinde farklı lenf dokuları için de geçerlidir MDSC popülasyonlarının işleme ve immunophentyping için ayrıntılı bir yöntemdir. Özellikle, autoMACS zenginleştirme splenositlerin 4 Gr-1 azalması, dalak ve lenf düğümleri 5 ila myeloid alt saflaştırılması, CD8 kemik iliği nötrofiller 14 izolasyonu ve saflaştırılması + dalak den T hücreleri dahil olmak üzere çeşitli lökosit izolasyonu için kullanılabilir ve lenf düğü…
The authors have nothing to disclose.
Biz USF Akım Sitometri Çekirdek Tesisi kabul ediyorsunuz. Biz kaynaklarının paylaşımı için Dr Denise Cooper teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca kurma ve bu video filme kendi yardım için Maya Cohen, Laura Pendleton ve Diana Latour teşekkür etmek istiyorum. NN Doktora Bursu HRD # 0929435 NSF FG-LSAMP Köprüsü tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma TG verilen Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu # 93-032-13/Moffitt Kanser Merkezi tarafından finanse edildi.
REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |