Dit is een snelle en uitgebreide methode van immunofenotypering myeloïde suppressor cellen (MDSC) en het verrijken van Gr-1<sup> +</sup> Leukocyten van muis milt. Deze methode maakt gebruik van flow cytometrie en AutoMACS celsortering te verrijken voor levensvatbare Gr-1<sup> +</sup> Leukocyten voor FACS sorteren van MDSC voor<em> In vivo</em> En<em> In vitro</em> Assays.
MDSC zijn een heterogene populatie van onvolwassen macrofagen, dendritische cellen en granulocyten die zich ophopen in de lymfoïde organen in pathologische aandoeningen, waaronder parasitaire infectie, ontsteking, traumatische stress, graft-versus-host-en vaatziekten, diabetes en kanker 1-7. Bij muizen, MDSC express Mac-1 (CD11b) en Gr-1 (Ly6G en Ly6C) oppervlakte-antigenen 7. Het is belangrijk op te merken dat MDSC goed worden bestudeerd in verschillende tumor-dragende hosts waar ze aanzienlijk worden uitgebreid en anti-tumor immuunrespons ten opzichte van naïeve collega's 7-10 te onderdrukken. Afhankelijk van de pathologische aandoening er verschillende subpopulaties MDSC met verschillende mechanismen en doelen van onderdrukking 11,12. Doeltreffende methoden levensvatbare MDSC populaties isoleren belangrijk in het ophelderen van de moleculaire mechanismen van onderdrukking in vitro en in vivo.
Onlangs heeft de Ghansah groep heeft gemeld de uitbreiding van MDSC in een muizen alvleesklierkanker model. Onze tumor-dragende MDSC tonen een verlies van homeostase en een verhoogde onderdrukkende functie in vergelijking met naïeve MDSC 13. MDSC percentages zijn beduidend minder in de lymfoïde compartimenten van naïeve versus tumor-dragende muizen. Dit is een belangrijke voorbehoud dat vaak belemmert nauwkeurige analyse van deze vergelijkende MDSC. Daarom is het verrijken van Gr-1 + leukocyten van naïeve muizen voorafgaand aan Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) verhoogt de zuiverheid, de levensvatbaarheid en vermindert de soort tijd. Echter, verrijking van Gr-1 + leukocyten van tumor-dragende muizen is optioneel, omdat deze zijn er in overvloed voor een snelle FACS sorteren. Daarom is in dit protocol beschrijven we een zeer efficiënte methode voor het immunofenotypering MDSC en verrijkende Gr-1 + leukocyten van de milt van naïeve muizen voor het sorteren van MDSC tijdig. Immunocompetente C57BL / 6 muizen worden geënt met muizen Panc02 ceLLS subcutaan dat de naïeve muizen te ontvangen 1XPBS. Ongeveer 30 dagen na inoculatie; milt worden geoogst en verwerkt tot een cel suspensies behulp van een mobiele dissociatie zeef. Splenocyten worden dan rode bloedcellen (RBC) gelyseerd en een hoeveelheid van deze witte bloedcellen worden gekleurd met behulp van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen Mac-1 en Gr-1 tot immunofenotype MDSC percentages met behulp van flowcytometrie. In een parallel experiment worden hele leukocyten van naïeve muizen gekleurd met fluorescent geconjugeerde Gr-1 antilichamen, geïncubeerd met PE-microbolletjes en positief geselecteerde gebruikmaking van een automatische magnetische geactiveerde celsortering (autoMACS) Pro Separator. Vervolgens wordt een hoeveelheid van Gr-1 + leukocyten gekleurd met Mac-1-antilichamen aan de toename van MDSC percentages met behulp van flowcytometrie te identificeren. Nu deze Gr1 + verrijkte leukocyten klaar voor het sorteren van FACS MDSC worden gebruikt in vergelijkend analyses (naïeve tegen tumor-dragende) in in vivo en in vitro </em> assays.
Dit is een gedetailleerde methode voor de verwerking en immunophentyping MDSC populaties die van toepassing is op verschillende lymfoïde weefsels van verschillende diermodellen. In het bijzonder kan autoMACS verrijking worden gebruikt voor de isolatie van verschillende populaties leukocyten met Gr-1 uitputting van splenocyten 4 zuivering van myeloïde subsets van splenocyten en lymfeknopen 5 isolatie van beenmerg neutrofielen 14 en zuivering van CD8 + T cellen van milt en de …
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen de USF flowcytometrie Core Facility. We willen graag Dr Denise Cooper bedanken voor het delen van resources. Wij zouden ook graag Maya Cohen, Laura Pendleton en Diana Latour bedanken voor hun hulp bij het opzetten en filmen van deze video. NN ondersteund door NSF FG-LSAMP Brug naar het College voor Promoties Fellowship HRD # 0929435. Dit werk werd gefinancierd door de American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center uitgereikt aan TG.
REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |