C'est une méthode rapide et complète de l'immunophénotypage myéloïdes dérivées des cellules suppressives (MDSC) et l'enrichissement de Gr-1<sup> +</sup> Leucocytes de la rate de souris. Cette méthode utilise la cytométrie en flux et cellulaire autoMACS tri pour enrichir viable Gr-1<sup> +</sup> Leucocytes avant tri par FACS du MDSC pour une utilisation<em> In vivo</em> Et<em> In vitro</em> Tests.
MDSC sont une population hétérogène de macrophages, les cellules dendritiques immatures et des granulocytes qui s'accumulent dans les organes lymphoïdes dans des conditions pathologiques, y compris les infections parasitaires, l'inflammation, le stress traumatique, réaction du greffon contre l'hôte, le diabète et le cancer 1-7. Chez la souris, MDSC expresse Mac-1 (CD11b) et Gr-1 (Ly6G et Ly6C) antigènes de surface 7. Il est important de noter que MDSC sont bien étudiés dans divers porteurs d'une tumeur hôtes où ils sont sensiblement élargies et réprimer les anti-tumoraux des réponses immunitaires par rapport à leurs homologues naïfs 7-10. Toutefois, en fonction de l'état pathologique, il ya différentes sous-populations de MDSC avec des mécanismes distincts et les cibles de la répression 11,12. Par conséquent, des méthodes efficaces pour isoler des populations viables MDSC sont importants dans l'élucidation de leurs différents mécanismes moléculaires de la suppression in vitro et in vivo.
Récemment, le Ghansah groupe a signalé l'expansion de la MDSC dans un modèle murin du cancer du pancréas. Notre porteur de tumeurs MDSC afficher une perte de l'homéostasie et augmentation de la fonction suppressive par rapport à naïve MDSC 13. Pourcentages MDSC sont beaucoup moins dans les compartiments lymphoïdes de souris naïves vs porteur de tumeurs. Il s'agit d'une mise en garde majeure, qui empêche souvent les analyses comparatives précises de ces MDSC. Par conséquent, l'enrichissement de Gr-1 + leucocytes chez des souris naïves avant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) améliore la pureté, la viabilité et réduit considérablement le temps de tri. Toutefois, l'enrichissement de la Gr-1 + leucocytes de souris porteuses de tumeurs est facultative car ceux-ci sont en abondance pour FACS rapides de tri. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons une méthode très efficace de immunophénotypage MDSC et enrichissante Gr-1 + leucocytes de la rate de souris naïves pour le tri MDSC en temps opportun. Immunocompétents souris C57BL / 6 sont inoculés avec murin Panc02 CElls voie sous-cutanée alors que les souris naïves recevoir 1XPBS. Environ 30 jours après l'inoculation; rates sont récoltées et transformées en une seule cellule suspensions en utilisant un tamis de dissociation cellulaire. Les splénocytes sont ensuite globules rouges (RBC) lysées et une aliquote de ces leucocytes sont colorés en utilisant conjugués au fluorochrome des anticorps contre Mac-1 et Gr-1 à des pourcentages immunophénotype MDSC par cytométrie en flux. Dans une expérience parallèle, les leucocytes entiers de souris naïves sont colorées avec fluorescente conjugués GR-1, incubées avec des anticorps PE-microbilles et sélectionné de façon positive à l'aide un système automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS) Pro Separator. Ensuite, une aliquote de GR-1 + de leucocytes sont colorés avec Mac-1 anticorps pour identifier les l'augmentation des pourcentages MDSC par cytométrie en flux. Maintenant, ces Gr1 + de leucocytes enrichis sont prêts pour tri par FACS du MDSC à être utilisé dans les analyses comparatives (naïve vs porteur de tumeurs) in vivo et in vitro </em> tests.
Il s'agit d'une méthode détaillée pour le traitement et immunophentyping populations MDSC qui est applicable à différents tissus lymphoïdes de modèles animaux différents. En particulier, l'enrichissement autoMACS peut être utilisé pour l'isolement des différents populations de leucocytes comprenant Gr-1 épuisement des splénocytes 4, la purification de sous-ensembles à partir de splénocytes myéloïdes et les ganglions lymphatiques 5, isolement de la moelle osseuse neu…
The authors have nothing to disclose.
Nous reconnaissons le flux USF cytométrie Core Facility. Nous tenons à remercier le Dr Denise Cooper pour le partage des ressources. Nous aimerions également remercier Maya Cohen, Laura Pendleton et Diana Latour pour leur aide dans la mise en place et le tournage de cette vidéo. NN soutenu par la NSF FG-LSAMP pont à la bourse de doctorat DRH # 0929435. Ce travail a été financé par l'American Cancer Society Research Grant # institutionnel 93-032-13/Moffitt Cancer Center attribué à TG.
REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |