Summary

フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別(AutoMACS)を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞(MDSC)の調製

Published: June 18, 2012
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Summary

これは、ミエロイド系のサプレッサー細胞(MDSC)をイムノおよびGr-1を豊かにし、迅速かつ包括的な方法です<sup> +</supマウスの脾臓から>白血球。このメソッドは、実行可能なGR-1に濃縮するために選別フローサイトメトリーとAutoMACSセルを使用しています<sup> +</sup使用するためにMDSCのソート、FACSの前に>白血球<emin vivoでの></em>と<em> in vitroで</em>アッセイ。

Abstract

MDSCは、寄生虫感染、炎症、外傷後ストレス、移植片対宿主病、糖尿病や癌1から7を含む病理学的条件下でリンパ系器官に蓄積される未熟なマクロファージ、樹状細胞および顆粒球の不均一な集団である。マウスでは、MDSCエクスプレスMAC-1(CD11bを)とGR-1(Ly6GとLy6C)の表面抗原7。 MDSCはよくそれらが大幅に拡大し、7月10日ナイーブな対応に比べて抗腫瘍免疫応答を抑制されている各種担癌宿主内で研究されていることに注意することは重要です。しかし、病態に応じて、抑制11,12の別個のメカニズムやターゲットとMDSCの異なる亜集団が存在する。したがって、実行可能なMDSC集団を分離するための効果的な方法は、in vitroおよび in vivo 抑制のそれぞれ異なる分子メカニズムの解明において重要である。

最近、Ghansahグループは、マウスの膵臓癌モデルでMDSCの拡大を報告しています。私たちの担癌MDSCは、恒常性の損失を表示し、ナイーブなMDSC 13に比べて抑制機能を増加させた。 MDSC割合はナイーブ対担癌マウスのリンパ系のコンパートメントで有意に少なくなります。これは、しばしばこれらのMDSCの正確な比較分析を妨げている主要な警告です。したがって、前の蛍光活性化セルソーティング(FACS)にナイーブマウスからのGr-1 +白血球を豊かにすると、純度、生存率を高め、大幅にソート時間が短縮されます。これらはソートクイックFACSのために豊富にありますしかし、担癌マウスからのGr-1 +白血球の濃縮はオプションです。したがって、このプロトコルでは、我々はMDSCをイムノタイムリーにMDSCをソートするためのナイーブマウスの脾臓からのGr-1 +白血球を濃縮する非常に効率的な方法を説明します。免疫C57BL / 6マウスは、マウスPanc02 CEを接種するナイーブなマウスは、1XPBSを受け取るのに対し、皮下LLS。約30日後に接種、脾臓細胞解離ふるいを使用して単一細胞懸濁液に収穫し、処理されます。脾細胞は、その後赤血球(RBC)を溶解し、これらの白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いた免疫表現型MDSC割合にMac-1とGR-1に対する蛍光標識抗体を用いて染色されています。平行実験で、ナイーブマウスからの全白血球は蛍光標識のGr-1抗体、PE-MicroBeadsでインキュベートし、積極的に自動化された磁気活性化細胞選別(autoMACS)プロ区切り記号を使用して、選択した状態で染色されています。次に、GR-1 +白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いてMDSC割合の増加を識別するためにMac-1抗体で染色されています。今、これらのGR1 +濃縮白血球 、in vivo および in vitro の比較分析(ナイーブ対担癌)で使用するMDSCのソートFACSの準備ができている</em>のアッセイ。

Protocol

開始する前に、次の解決策を準備します。 3%の染色メディア(SM): 1Xリン酸緩衝生理食塩水で3%ウシ胎児血清(FBS)(PBS) MACSバッファー(MB): – 1XPBSでウシ血清(BSA)から0.5%アルブミン 1。マウスから収穫脾臓皮下に100μlの1X PBS(; TB担癌)に懸?…

Discussion

これは、様々な動物モデルから別のリンパ組織にも適用可能であるMDSC集団を処理し、immunophentypingの詳細な方法です。特に、autoMACSの濃縮は、脾細胞4のGR-1の枯渇、脾臓細胞、リンパ節5から骨髄のサブセットの精製、CD8の骨髄好中球14の単離および精製+脾臓からT細胞を含む種々の白血球集団の分離に使用することができますとリンパ節15。かかわらず?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、USFのフローサイトメトリーコアファシリティを認める。我々は、リソースを共有するためにドクターデニス·クーパーに感謝します。また、設定とこのビデオの撮影に、その支援のためのMayaコーエン、ローラペンドルトンとダイアナラトゥールに感謝します。 NNは博士号フェローシップHRD#0929435にNSF FG-LSAMPブリッジによってサポートされています。この仕事はTGに授与米国癌学会機関研究助成#93-032-13/Moffittがんセンターによって資金を供給された。

Materials

REAGENT COMPANY CATALOG # COMMENTS
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBiosciences 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBiosciences 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBiosciences 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBiosciences 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Scientific 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545  
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101  
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221  

References

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Cite This Article
Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

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