フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（AutoMACS）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）の調製
Summary
これは、ミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）をイムノおよびGr-1を豊かにし、迅速かつ包括的な方法です<sup> +</supマウスの脾臓から>白血球。このメソッドは、実行可能なGR-1に濃縮するために選別フローサイトメトリーとAutoMACSセルを使用しています<sup> +</sup使用するためにMDSCのソート、FACSの前に>白血球<emin vivoでの></em>と<em> in vitroで</em>アッセイ。
Abstract
MDSCは、寄生虫感染、炎症、外傷後ストレス、移植片対宿主病、糖尿病や癌1から7を含む病理学的条件下でリンパ系器官に蓄積される未熟なマクロファージ、樹状細胞および顆粒球の不均一な集団である。マウスでは、MDSCエクスプレスMAC-1（CD11bを）とGR-1（Ly6GとLy6C）の表面抗原7。 MDSCはよくそれらが大幅に拡大し、7月10日ナイーブな対応に比べて抗腫瘍免疫応答を抑制されている各種担癌宿主内で研究されていることに注意することは重要です。しかし、病態に応じて、抑制11,12の別個のメカニズムやターゲットとMDSCの異なる亜集団が存在する。したがって、実行可能なMDSC集団を分離するための効果的な方法は、in vitroおよび in vivo で抑制のそれぞれ異なる分子メカニズムの解明において重要である。
最近、Ghansahグループは、マウスの膵臓癌モデルでMDSCの拡大を報告しています。私たちの担癌MDSCは、恒常性の損失を表示し、ナイーブなMDSC 13に比べて抑制機能を増加させた。 MDSC割合はナイーブ対担癌マウスのリンパ系のコンパートメントで有意に少なくなります。これは、しばしばこれらのMDSCの正確な比較分析を妨げている主要な警告です。したがって、前の蛍光活性化セルソーティング（FACS）にナイーブマウスからのGr-1 +白血球を豊かにすると、純度、生存率を高め、大幅にソート時間が短縮されます。これらはソートクイックFACSのために豊富にありますしかし、担癌マウスからのGr-1 +白血球の濃縮はオプションです。したがって、このプロトコルでは、我々はMDSCをイムノタイムリーにMDSCをソートするためのナイーブマウスの脾臓からのGr-1 +白血球を濃縮する非常に効率的な方法を説明します。免疫C57BL / 6マウスは、マウスPanc02 CEを接種するナイーブなマウスは、1XPBSを受け取るのに対し、皮下LLS。約30日後に接種、脾臓細胞解離ふるいを使用して単一細胞懸濁液に収穫し、処理されます。脾細胞は、その後赤血球（RBC）を溶解し、これらの白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いた免疫表現型MDSC割合にMac-1とGR-1に対する蛍光標識抗体を用いて染色されています。平行実験で、ナイーブマウスからの全白血球は蛍光標識のGr-1抗体、PE-MicroBeadsでインキュベートし、積極的に自動化された磁気活性化細胞選別（autoMACS）プロ区切り記号を使用して、選択した状態で染色されています。次に、GR-1 +白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いてMDSC割合の増加を識別するためにMac-1抗体で染色されています。今、これらのGR1 +濃縮白血球は 、in vivo および in vitro での比較分析（ナイーブ対担癌）で使用するMDSCのソートFACSの準備ができている</em>のアッセイ。
Protocol
Discussion
これは、様々な動物モデルから別のリンパ組織にも適用可能であるMDSC集団を処理し、immunophentypingの詳細な方法です。特に、autoMACSの濃縮は、脾細胞4のGR-1の枯渇、脾臓細胞、リンパ節5から骨髄のサブセットの精製、CD8の骨髄好中球14の単離および精製+脾臓からT細胞を含む種々の白血球集団の分離に使用することができますとリンパ節15。かかわらず?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、USFのフローサイトメトリーコアファシリティを認める。我々は、リソースを共有するためにドクターデニス·クーパーに感謝します。また、設定とこのビデオの撮影に、その支援のためのMayaコーエン、ローラペンドルトンとダイアナラトゥールに感謝します。 NNは博士号フェローシップHRD＃0929435にNSF FG-LSAMPブリッジによってサポートされています。この仕事はTGに授与米国癌学会機関研究助成＃93-032-13/Moffittがんセンターによって資金を供給された。
Materials
| REAGENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Heat Inactivated; Sterile Environment |
| Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Sterile Environment |
| Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Sterile Environment |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Sterile Environment |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Serial Dilution Sterile Environment |
| Cell Dissociation Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave before use |
| 70-μm strainer | BD Biosciences | 352350 | Sterile Environment |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Warm to room temperature before use; Sterile Environment |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | Sterile Environment |
| 50ml conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Sterile Environment |
| 5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes | BD Biosciences | 352054 | Known as FACS tubes; Sterile Environment |
| 96-well V-bottom plates | Corning | 3897 | Sterile Environment |
| Trypan Blue | Cellgro | 25-900-CI | Sterile Environment |
| PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Sterile Environment |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| AutoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| AutoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |
References
- Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
- Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
- Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
- Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
- Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
- Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
- Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
- Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
- Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
- Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
- Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
- Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
- Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
- Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
- Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
- Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
- Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
- Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
- Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).
