AVEXIS является высокая пропускная способность белковых взаимодействий анализа разработаны систематически экран роман внеклеточный рецептор-лиганд пары, участвующие в клеточных процессах признания. Она специально разработана для обнаружения переходных взаимодействий белков, которые трудно определить с помощью других подходов, высокой пропускной способностью.
Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives < 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2.
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 ≤ 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (β-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.
Когда живые клетки наблюдается в естественных условиях, их мембраны плазмы демонстрируют высокую динамику поведения: расширение и процессы втягивания мембраны как они входят в контакт и общаться со своими соседями 2. Физическое взаимодействие между мембраной встроенный рецепторные белки, которые опосредуют многие из этих контактов развивались чрезвычайно слаба, чтобы при этом очень подвижны поведения. Было подсчитано, что мономерные сильные взаимодействия, слабые до 50 мкм может быть достаточно, чтобы управлять спонтанного взаимодействия на физиологические концентрации рецептора 9, который делает выявление новых взаимодействий чрезвычайно сложной 2,10. Метод AVEXIS описанный здесь является чувствительным методом для определения переходных внеклеточный белок: белковых взаимодействий, которые могут быть реализованы в масштабируемых образом с низким уровнем ложных срабатываний. В то время как другие масштабируемые методы были разработаны для обнаружения внеклеточные взаимодействия 11-15,Одним из преимуществ является то, что AVEXIS экспериментальные параметры, такие как приманка и добыча мероприятия были количественно обнаружить даже самые слабые взаимодействия (Т 1/2 ≤ 0,1 с), сохраняя при этом низкий процент ложных срабатываний 3. Кроме того, рациональный и надежный процедуры подготовки пробы позволили этого анализа будет осуществляться на гораздо большем масштабе, чем в других тестах, и мы недавно описал систематическое взаимодействие экрана на общую сумму свыше ~ 16 500 потенциальных взаимодействий 16.
Анализ может быть выполнена на любой белок, для которых можно выразить растворимый рекомбинантный фрагмент белка. Таким образом, это включает в себя белки, содержащие N-терминального сигнального пептида, такие как тип I, GPI-связанные и секретируемых белков. Недавно мы разработали набор векторов, что теперь позволяет нам выразить типа II белка как приманку 17. Анализ как правило, не подходит для многопроходной мембранных белков, таких как ион транспортерс или насосы, так как они вряд ли будет правильно сложить вне контекста мембране. Мы использовали это различные системы и успешно выразил внеклеточных белков данио 3,16,18, человека, мыши и П. тропической взаимодействия экранов.
С точки зрения ресурсов, необходимых для создания экрана AVEXIS, мы обнаружили, что значительное узким местом является выбор, строительство и полное секвенирование выражение плазмид. Этот аспект метода может занять до года, чтобы ~ 100 приманки и добычу конструкции, однако, с уменьшением стоимости ген синтеза, мы сейчас выступаем коммерческой аутсорсинга этот аспект проекта. Млекопитающих система выражения вместе с большой тряски культуры тканей инкубатор (мы используем INFORS HT Multitron Cell) позволяет одному исследователю, чтобы выразить и нормализовать до ~ 100 приманки и добычи белки в месяц. Как только белки производятся и нормализовалась, сcreening для взаимодействий с быстрым до двенадцати 96-луночных быть удобно, обрабатываемых за один день. Только на заказ оборудования, которые мы разработали для облегчения производства такого большого количества белков сжатого воздуха управляемой поршень, который используется для передачи до пяти супернатантов через 0.22μm фильтр параллельно.
Основной класс взаимодействий, которые могут быть пропущены по сравнению с взаимодействием ожидать от литературы (ложных негативов) являются homophilic взаимодействия, хотя некоторые из этих взаимодействий может быть обнаружено 3. В тех случаях, когда ожидаемый взаимодействия не обнаружено, мы считаем, что это связано с формированием homophilic взаимодействий белков добычу (добычу "маскировки" эффект), которые затем предотвращает дальнейшее взаимодействие с иммобилизованными белками приманки. Частота, при которой взаимодействие обнаружены зависит от содержания белка библиотеке проходит проверку. В качестве ориентира для читателя, экран> 30000 взаимодействия в данио надсемейства иммуноглобулинов привело в 188 срабатываний – частота 0,6% 3,16,18. Очень быстрой проверки, которые могут быть выполнены, чтобы проверить любое положительное хитов для определения взаимодействия могут быть обнаружены и в приманку-жертва ориентации, которые, может же быть обнаружены взаимодействия независимо от того, белки присутствуют либо как приманка или добычу. Всякий раз, когда мы наблюдали это возвратно-поступательное движение поведения, обязательные впоследствии было показано, что определенный, демонстрируя прямую насыщающимся связывания белков с использованием очищенного поверхностного плазменного резонанса. Следует подчеркнуть, что, поскольку мы увеличиваем обязательный алчность искусственно pentamerising добычу белки, мы не считаем, пригодных для анализа количественного сравнения взаимодействие сил. Для получения биофизических параметров связывания взаимодействия мы используем мономерные белки и резонанс поверхностных плазмонов. Наконец, когда взаимодействие было выявлено, приветGH природы пропускной способности анализа позволяет относительно легко адаптировать анализ для выявления реагентов, таких как антитела и малые молекулы, которые блокируют взаимодействие.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа выполнена при финансовой поддержке Wellcome Trust грант № [077108] присуждена GJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |