AVEXIS 세포 인식 프로세스에 관련된 소설 세포 수용체 – 리간드 쌍을 체계적 화면으로 개발된 높은 처리량 단백질 상호 작용 분석이다. 그것은 구체적으로 다른 높은 처리량 접근 방식을 사용하여 식별하기 어려운 일시적인 단백질 상호 작용을 감지할 수 있도록 설계되었습니다.
세포외 단백질 : 분비 또는 멤브레인 – 곁에 단백질 간의 단백질 상호 작용은 다세포 유기체 내에서 두 세포 사이 커뮤니케이 션을 시작하고 보장 결합에 중요합니다. 단백질은 세포의 상호 작용이 인간의 유전자 약 1 분기까지 인코딩됩니다 형성 예측하지 않았지만, 그들의 중요성과 풍요로움에도 불구하고, 이러한 단백질의 대부분은 아무런 구속력 파트너를 문서화했습니다. 주로, 이것은 그들의 생화 학적 다루기 힘듦로 인한 것입니다 : 멤브레인 – 임베디드 단백질들의 기본 형태에 solubilise하기가 어렵습니다 그리고 구조적으로 – 중요한 posttranslational 수정 사항이 포함되어 있습니다. 또한, 수용체 단백질 간의 상호 작용 동질성은 종종 많은 일반적으로 사용되는 높은 처리량 방법 2 그들 감지 precluding 매우 낮은 상호 작용 강점 (반 생활 <1 초)을 특징으로하고 있습니다.
여기서는 AVEXIS은 (욕망 기반 EXtracellu, 분석을 설명낮은 거짓 긍정적인 속도 3 매우 약한 단백질 상호 작용 (T 2분의 1 ≤ 0.1 초)의 검출을 가능하게 이러한 기술적 과제를 극복 고맙다 상호 작용 스크린). 분석은 일반적으로 편리한 microtitre 플레이트 형식의 상호 작용 (그림 1)의 많은 수천의 체계적인 심사를 활성화하기 위해 높은 처리량 형식으로 구현됩니다. 그것은 상호 작용을 위해 구분할 어느 이내에 세포 표면 수용체이나 분비 단백질 ectodomain 포함할 수용성 재조합 단백질 라이브러리의 생산에 의존하므로, 이러한 방식은 유형에 적합 I, 타입 II, GPI-연결된 세포 표면 수용체와 분비 단백질하지만 이러한 이온 채널 또는 전송기와 같은 multipass 막 단백질입니다.
재조합 단백질 라이브러리는 같은 glycosyla 같은 중요한 posttranslational 수정을 위해, 편리하고 높은 수준의 포유류의 표현 시스템 4를 사용하여 생산됩니다기 및 disulphide 채권이 추가됩니다. 심사에 적합한 streptavidin-코팅 견고한 위상에 캡처할 수 biotinylated 미끼, 그리고 pentamerised 효소 – 태그를 (β-lactamase) 먹이 : 표현 재조합 단백질은 매체와 두 가지 형태로 생산으로 분비된다. 유인 먹이 단백질은 종래의 엘리사 (그림 1)과 비슷한 둘 사이에 직접적인 상호 작용을 검출하는 바이너리 방식으로 서로 제공됩니다. 먹이의 단백질의 pentamerisation은 연골의 oligomeric 모체 단백질 (광고)에서 펩타이드 시퀀스를 통해 달성함으로써 심지어 아주 과도 상호 작용이 감지 수 있도록 큰 욕망 향상을 제공 ectodomains의 지방 농도를 증가하고 있습니다. 미끼 및 심사에 앞서 미리 정해진 수준으로 먹이 모두의 활동을 정상화함으로써, 우리는 0.1 초 중 monomeric 하프 생명을 가진 상호 작용이 낮은 거짓 긍정적인 속도로 3 감지할 수 것으로 나타났습니다.
살아있는 세포가 생체내에서 관찰하면, 자신의 플라즈마 점막은 매우 역동적인 동작을 전시 : 그들이 연락하여 그들의 이웃이와 통신으로 확장하고 retracting 막 프로세스. 다음 연락처에 많은 중재 멤브레인 – 임베디드 수용체 단백질 사이의 물리적 상호 작용이 높은 운동성이있는 행위를 허용하는만큼 매우 약한 것으로 진화했습니다. 그것은 50 μm의 같은 약하 monomeric 상호 작용 강도는 매우 2,10 도전 소설 상호 작용을 검출하게 생리학 수용체 밀도 9시 자발적인 상호 작용을 유발하기에 충분있을 것으로 추정되었습니다. 낮은 거짓 긍정적인 속도로 확장 가능한 방식으로 구현할 수있는 단백질 상호 작용 : 여기에서 설명한 AVEXIS 방식 과도 세포외 단백질을 검출하는 민감한 방법을 제공합니다. 다른 확장 방법은, 세포 상호 작용 11-15 감지하기 위해 개발되어 있지만AVEXIS 중 하나 장점은 미끼와 먹이 활동과 같은 실험 매개 변수가 낮은 허위 양성 반응 속도 3을 유지하면서도 (T 2분의 1 ≤ 0.1 s의) 상호 작용의 약한를 감지 계량되어있다는 것입니다. 또한, 간편하고 강력한 시료 준비 과정은 다른 assays보다 훨씬 더 큰 규모로 구현되어이 분석을 활성화했으며 최근 ~ 16,500 잠재적인 상호 작용을 통해 총 16 체계적인 상호 작용 화면을 설명했습니다.
분석은 그것이 수용성 재조합 단백질 조각을 표현하는 것이 가능하는 모든 단백질을 수행할 수 있습니다. 이것은 따라서 이러한 유형 I, GPI-링크 및 분비 단백질과 같은 N-터미널 신호 펩티드를 포함하는 단백질이 포함되어 있습니다. 우리는 최근에 지금 우리가 baits 17로 타입 II 단백질을 표현할 수 있도록 벡터의 제품군을 설계했습니다. 분석은 일반적으로 이러한 이온 수송 등 multipass 막 단백질에 적합하지s 또는 그들이 올바르게 플라즈마 막의 컨텍스트 외부 접혀되지 않을 수 있습니다 있기 때문에 펌프. 우리는 zebrafish 3,16,18, 인간, 마우스 및 P.으로부터 세포외 단백질을 서로 다른 다양한 시스템에 이것을 적용하고 성공적으로 표현했습니다 상호 작용 화면에 대한 falciparum.
AVEXIS 화면을 설정하는 데 필요한 자원의 측면에서 우리는 상당한 병목 현상이 선정, 건설 및 표현 plasmids의 전체 시퀀싱 것으로 나타났습니다. 메서드의 이러한 양상은 ~ 100 유인 먹이 구조를 만들기 위해 일년까지 걸릴 수 있으나, 유전자 합성의 감소 비용과 함께, 우리는 프로젝트의이 부분을 아웃소싱 상업적으로 선호. 대형 떨고 조직 문화 인큐베이터 (우리가 INFORS HT Multitron 전지 사용)와 함께 포유류의 표현 시스템은 표현하고 ~ 100 유인 먹이 단백질 개월까지 정상화하기위한 하나의 연구원 수 있습니다. 단백질은 생산 초, 정상화되면상호 작용에 대한 creening하면 편리 하루에 처리되는 정오까지 96 – 웰 플레이트와 빠른 속도입니다. 우리가 단백질 등 다수의 생산을 촉진하기 위해 개발한 것으로 유일 주문품의 장비는 병렬 0.22μm 필터를 통해 다섯 supernatants까지 전달하는 데 사용되는 압축 공기 구동 피스톤입니다.
이러한 상호 작용의 일부가 3 감지할 수 있지만 문학 (거짓 네거티브 필름)에서 예상 상호 작용에 비해 놓칠 수있을 상호 작용의 주 클래스는 homophilic 상호 작용입니다. 예상되는 상호 작용이 감지되지 않는 경우에, 우리는이 그때 고정화 미끼 단백질로 추가 상호 작용을 방지 먹이 단백질 (먹이 "마스킹"효과)에 의해 homophilic 상호 작용의 형성에 의한 것을 믿습니다. 상호 작용이 발견되는 빈도가 상영되는 단백질 라이브러리의 내용에 따라 달라집니다. 리더에 대한 안내,> 30의 화면으로, zebrafish 면역 글로불린 superfamily 이내 000 상호 작용 188 긍정적 결과 – 0.6 % 3,16,18의 주파수를. 모든 긍정적인 조회수를 확인하는 데 수행할 수 매우 빠른 검사는 상호 작용이 미끼 – 먹이의 방향 모두에서 감지할 수 있는지 여부를 확인하는 것입니다,, 같은 상호 작용은 미끼 중으로 바인딩 단백질이 존재하는지 여부에 관계없이 감지할 수있다 그 또는 먹이. 우리가이 왕복 동작을 관찰했을 때마다 바인딩은 연속적 표면 plasmon 공명을 사용하여 단백질 투석을 직접 saturable 바인딩을 시연하여 명확하게 표시되었습니다. 그것은 우리가 인위적으로 먹이 단백질을 pentamerising하여 바인딩 욕망을 증가하기 때문에, 우리는 양적 상호 작용의 장점을 비교하기위한 적절한 분석을 고려하지 않는 것이 강조되어야한다. 우리가 monomeric 단백질 및 표면 plasmon의 공명을 사용하여 상호 작용 biophysical 바인딩 매개 변수를 구하십시오. 마지막으로 한 상호 작용이 확인되었습니다, 안녕하세요분석의 GH 처리량 자연은 항체 또는 상호 작용을 차단하는 작은 분자와 같은 시약을위한 화면 분석을 적응하기가 비교적 쉽습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 Wellcome 신탁 기금 번호 [077108]에 의해 지원되었다 GJW에게 수여.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |