Summary
AVEXIS هو بروتين إنتاجية عالية مقايسة التفاعل المتقدمة إلى الشاشة بشكل منتظم لرواية أزواج مستقبلات يجند خارج الخلية المشاركة في عمليات التعرف على الخليوي. وهي مصممة خصيصا للكشف عن بروتين تفاعلات عابرة يصعب تحديد استخدام غيرها من النهج إنتاجية عالية.
Abstract
بروتين خارج الخلية: التفاعلات بين البروتينات أو تفرز بروتينات غشاء المربوطة حاسمة بالنسبة لكل من التماسك بدء الاتصالات بين الخلايا، وضمان في الكائنات متعددة الخلايا. وتوقع لتشكيل البروتينات يتم ترميز التفاعلات خارج الخلية بمقدار الربع تقريبا من الجينات البشرية 1، ولكن على الرغم من أهميتها وفرة، وغالبية هذه البروتينات وقد وثقت لا شريك ملزم. في المقام الأول، وهذا يرجع إلى استعصاء على البيوكيميائية: بروتينات غشاء جزءا لا يتجزأ من الصعب solubilise في التشكل وطنهم وتحتوي على تعديلات posttranslational الهيكلية الهامة. أيضا، وتتميز في كثير من الأحيان الانتماءات تفاعل بين البروتينات المستقبلة من قبل القوة تفاعل منخفضة للغاية (نصف حياة <1 2) النافية الكشف عنها مع العديد من الشائع استخدام أساليب إنتاجية عالية 2.
هنا، نحن تصف فحص، AVEXIS (الطمع القائم على EXtracelluلار التفاعل الشاشة) أن يتغلب على هذه التحديات التقنية التي تمكن من الكشف عن تفاعلات البروتين ضعيف جدا (ر 1/2 ≤ 0.1 ثانية) مع انخفاض معدل إيجابية كاذبة 3. وينفذ عادة الفحص في شكل إنتاجية عالية لتمكين فحص المنتظم لعدة آلاف من التفاعلات في شكل لوحة microtitre مناسب (الشكل 1). لأنه يعتمد على إنتاج بروتين قابل للذوبان المكتبات المؤتلف التي تحتوي على شظايا ectodomain من مستقبلات سطح الخلية أو البروتينات يفرز من خلاله للكشف عن التفاعلات، وبالتالي، فإن هذا النهج هو مناسبة لنوع أنا، من النوع الثاني، GPI المرتبطة مستقبلات سطح الخلية وتفرز البروتينات ولكن ليس للبروتينات غشاء المتعددة الدخول مثل القنوات الأيونية أو النقل.
ويتم إنتاج بروتين المؤتلف المكتبات باستخدام مريحة وعلى مستوى رفيع نظام التعبير الثدييات 4، لضمان أن تعديلات هامة posttranslational مثل glycosylaتضاف نشوئها وثاني كبريتيد السندات. تفرز البروتينات المؤتلف وأعرب في المتوسط والتي تنتج في شكلين: الطعم المعقدة البيروكسيديز التي يمكن الحصول عليها في مرحلة streptavidin المغلفة صلبة مناسبة للفحص، وpentamerised انزيم الموسومة فريسة (β-اكتاماز). يتم تقديم الطعم والبروتينات فريسة لبعضها البعض على نحو ثنائي للكشف عن التفاعلات المباشرة بينهما، على غرار ELISA التقليدية (الشكل 1). يتحقق pentamerisation من البروتينات في الفريسة من خلال سلسلة ببتيد من المصفوفة بروتين غضروف oligomeric (شركات) ويزيد من تركيز المحلية لectodomains مما يوفر مكاسب كبيرة لتمكين الطمع إلى أن يتم الكشف عن التفاعلات حتى عابر جدا. من قبل تطبيع أنشطة الطعم على حد سواء وفريسة لمستويات محددة سلفا قبل الفرز، وأظهرنا أنه يمكن الكشف عن وجود تفاعلات أحادى نصف حياة 0.1 ثانية مع انخفاض معدلات إيجابية كاذبة 3.
Protocol
1. تجميع مكتبة من الطعم وبري ناقلات البلازميد التعبير عن
- تجميع قائمة من مستقبلات سطح الخلية والبروتينات يفرز من مصلحة ليتم عرضه للتفاعل واسترجاع تسلسل الخاصة بهم من قاعدة بيانات بروتين تسلسل مناسب. معظم البروتينات التي تحتوي على إشارة إفرازي N-محطة الببتيد هي مناسبة (وتشمل هذه الفئة الأولى، ومؤشر التكافؤ بين الجنسين مرتبط تفرز البروتينات). عادة، وسيتم اختيار لعائلة البروتينات (مثل فوق الفصيلة المناعي أو جميع المستقبلات تقتصر على نوع من الخلايا محددة مثل كرات الدم الحمراء).
- تحديد مدى المناطق خارج الخلية من خلال تحديد مكان وجود الببتيد إشارة والمنطقة عبر الغشاء باستخدام البرمجيات بروتين التنبؤ الميزة. نحن عادة ما تستخدم V3.0 SignalP 5 و 6 TMHMM V2.0.
- مجموعات التمهيدي تصميم أن تضخيم شظية ectodomain كامل لكل مستقبل. لدينا مجموعة من الطعم وناقلات فريسة التي هي مناسبة لهذا الغرض والتي هيتوفرة من Addgene ( http://www.addgene.org/~~V ). تصميم التمهيدي حول معنى بداية ميثيونين لتشمل تقييد انزيم NOTI موقع وتسلسل كوزاك الأمثل، ويلي ذلك أزواج قاعدة 25 من تطابق تام جينة محددة تسلسل (الشكل 2A).
- تصميم التمهيدي العقاقير لاقتطاع نوع من البروتينات المستقبلة أنا فقط قبل إلى المنطقة عبر الغشاء كما تنبأ بذلك للتعبير عن ectodomain بأسره البروتين المؤتلف للذوبان. وتشمل تقييد موقع زقاق في هذا التمهيدي الذي ينبغي أن تترجم بعد ذلك في إطار لفأر C-محطة Cd4d3 العلامة بروتين +4 7 (الشكل 2A).
- تضخيم شظايا ectodomain من جميع الجينات باستخدام هذه المشارع واستنساخ لهم في الطعم أو ناقلات فريسة. نجد أحيانا أنه من المفيد لاستنساخ لهم أولا إلى ناقلات المكوك قبل subcloning الى ناقلات التعبير الثدييات مناسبا، ونحن نستخدم مشتق من ناقلات pTT3 3،4. كل من الطعم وناقلات فريسة contaiبه ن بروتين C-محطة على النحو التالي (الشكل 2B).
- الطعم: والتي تحتوي على علامة المجالات 3 و 4 من CD4 الفئران (Cd4d3 +4) بروتين تليها سلسلة الببتيد التي هي الركيزة للانزيم البيرا القولونية، وبالتالي يمكن monobiotinylated على بقايا 1 يسين محدد (الشكل 2B) . يتم التعرف على Cd4d3 +4 العلامة من قبل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في OX68، ويستخدم لقياس التعبير عن البروتينات الطعم بواسطة ELISA. البروتينات هي الطعم أحادى وبالتالي monobiotinylated. ناقلات إضافية من البروتين الطعم حيث يتم استبدال الببتيد biotinylatable بواسطة علامة 6 له لتنقية المتاحة.
- يفترس: ويفترس تحتوي أيضا على الفئران Cd4d3 +4 علامة تليها سلسلة ببتيد من البروتين غضروف الفئران مصفوفة oligomeric (شركات) ومحطة C-انزيم β-اكتاماز. الببتيد COMP يضمن فريسة أشكال pentamers أعرب مرة واحدة (الشكل 2B).
2. فريسة وبيت البروتين التعبير
نحن نستخدمينبغي أن يكون نظام ملائم التعبير على مستوى عال باستخدام ثقافة تعليق من خط خلية HEK293E 4 إلى إنتاج بروتين المكتبات لدينا، ولكن أي نظام التعبير الثدييات تكون مناسبة. وثمة بديل المتاحة تجاريا هو نظام حرة. عادة يتم استزراع خلايا على منصة يهز (125 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2 في الرطوبة النسبية 70٪. ويجب أيضا البروتينات سيطرة إيجابية وأخرى سلبية يمكن التعبير عنها. الفأر Cd4d3 +4 العلامة فقط جزء متاح كطعم على حد سواء، والفريسة وضوابط سلبية مناسبة. وبالمثل، والطعم، وفريسة النواقل التي ترميز سيطرة الإيجابية المتاحة (Addgene)، ونحن عادة استخدام الفئران Cd200-Cd200R تفاعل 8.
- بذور الخلايا HEK293E في اليوم السابق لترنسفكأيشن في مناطق ذات كثافة تبلغ 2.5 الخلايا × 5 10 مل -1. نحن ثقافة روتيني الخلايا في وحدات التخزين من 50 مل في وسائل الاعلام بعد Freestyle293 توصيات الشركة الصانعة. لضمان كفاءة biotinylation، تكملة تيانه خلية ثقافة المتوسط تستخدم لانتاج البروتينات الطعم مع مد البيوتين إلى تركيز النهائي من 100 ميكرون. الوسيلة المستخدمة للتعبير عن البروتينات فريسة لا تحتاج إلى أن تستكمل مع إضافية مد البيوتين.
- في اليوم التالي، وخلايا transfect باستخدام كاشف transfections مناسب (على سبيل المثال 293fectin). على 25 ميكروغرام من الطعم أو يبني البلازميد فريسة لثقافة transfect 50 مل. لإنتاج الطعوم المعقدة البيروكسيديز، وشارك في transfect الترميز البلازميد الطعم بناء مع البلازميد الذي يشفر شكل يفرز من يغاز البروتين البيوتين القولونية ( البيرة) والذي يتوفر من Addgene. البلازميدات الطعم المشترك transfect بنسبة 10:01 (2.5 ميكروغرام) من الترميز البلازميد البروتين يفرز البيرة.
- حصاد الثقافات خمسة أيام بعد ترنسفكأيشن بواسطة التكوير 1 الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3000 س ز لمدة 20 دقيقة تليها الترشيح من طاف من خلال 0.22 ميكرومتر مرشح.
[نصيحة: بيت والبروتين فريسةيجب أن يتم تخزين الصورة يضعف في درجة مئوية (4) وكما ينبغي أن تستخدم توجيهي عام في غضون سنة. إضافة bacteriostatics مثل 50 ميكروغرام / مل بوليميكسين ب سلفات أو 10 ملي نان 3 لمنع التلوث الجرثومي للsupernatants.]
3. التطبيع من الطعم وعينات بري
واحدة من السمات الرئيسية للمقايسة AVEXIS هو أنه بسبب تفرز البروتينات المؤتلف ويمكن تخفيفه أو أنها تتركز (تطبيع) لأنشطة ضمن حد معين، قبل أن يتم استخدامها في فحص. لقد وجدنا ان المستويات التي يتم التعبير عن البروتينات المؤتلف تغطي مجموعة واسعة - ما يصل إلى 4 أوامر من حجم - وبالتالي فإن خطوة تطبيع يقلل بشكل ملحوظ من عدد من ايجابيات كاذبة خلال الشاشات.
3،1 بيت تطبيع
ملاحظة: يجب إزالة Unconjugated مد البيوتين من وسائل الإعلام (عادة عن طريق غسيل الكلى) لأنه سوف تتنافس مع باى المعقدة البيروكسيديزتي بروتين للربط إلى streptavidin مواقع الربط.
- نقل supernatants الطعم في التسمية لغسيل الكلى، وأنابيب، مقطع بشكل آمن وعلى نطاق واسع ضد dialyse منطقة عازلة مناسبة مثل برنامج تلفزيوني لإزالة البيوتين الحرة.
[نصيحة: لقد وجدنا أن يتحقق عادة ما يكفي لغسيل الكلى لمدة 6 × 50 مل supernatants الطعم ضد وبلغ حجم التداول 4.5 لتر من برنامج تلفزيوني مع 4 تغييرات على مدى فترة 24 ساعة. ويمكن ملاحظة غير كافية لغسيل الكلى عن طريق تثبيط بروتين ملزمة في التخفيفات منخفضة خلال الطعم خطوة تطبيع (الشكل 3A).
- إجراء ELISA لتحديد المستويات النسبية التي يتم التعبير عن البروتينات الطعم. إعداد سلسلة التخفيف من البروتينات المعقدة البيروكسيديز الطعم والقبض عليهم على طبق من ذهب microtitre streptavidin المغلفة. استخدام الفئران Cd4d3 +4 علامة لكشف وتحديد البروتينات الطعم القبض على استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (OX68). التركيز أو تمييع البروتينات الطعم إلى الحد الأدنى المطلوب لتشبع كل بيوتفي مواقع الربط في البئر من لوحة streptavidin المغلفة.
- مخزنة منع آبار لوحة streptavidin المغلفة مع فوسفات saline/0.1٪ توين-20 (PBST) / 2٪ الأبقار مصل (BSA) لمدة 15 دقيقة.
- في لوحة منفصلة، واتخاذ سلسلة تخفيف (أربعة التخفيفات 01:03 وعادة ما تكون كافية) من البروتينات الطعم في جيش صرب البوسنة PBST / 2٪، ونقل إلى آبار لوحة streptavidin المغلفة. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل 3X في PBST. أضف 100 ميكروليتر من 2 ميكروغرام / مل الماوس لمكافحة الفئران Cd4d3 +4 مفتش (OX68) من الحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل 3X في PBST. أضف 100 ميكروليتر المضادة للفأر الفوسفاتيز القلوية في 1:5،000 في تخفيف PBST / BSA 2٪، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل 3X في PBST وإجراء غسيل نهائي في برنامج تلفزيوني لإزالة أي بقايا المنظفات. أضف 100 ميكروليتر من 1 ملغ / مل الركيزة 104 في المخزن الديثانولامين (الديثانولامين 10٪ (V / V)، 0.5mM MgCl 2، 10 ملي نان 3، pH9.8 وتخزينها بعيدا عن الضوء عند 4درجة مئوية).
- بعد ساعة واحدة، الامتصاصية التدبير في 405 نانومتر. وتظهر النتائج ممثل تطبيع الطعم في 3A الشكل.
- البروتينات الطعم الذي يتم التعبير عنها في المستويات التي لا تكفي لاشباع كل المواقع البيوتين ملزم من لوحة streptavidin المغلفة، عندما تستخدم يضعف، ينبغي أن تتركز باستخدام Vivaspin مركزات (Vivascience، 10kDa MWCO). كدليل، نقدر أن ~ 5 ميكروغرام من البروتين الطعم نموذجي (~ 80 كيلو دالتون) كافية لاشباع لوحة 96 أيضا.
- ويمكن تخفيفه البروتينات الطعم التي أعرب عنها في مستويات عالية في جيش صرب البوسنة PBST / 2٪ لتركيز كافية لتشبع لوحة streptavidin المغلفة. وينبغي أن أعادت التأكد من نشاط الطعوم بعد تخفيف أو تركيز للتأكد من أنها تشبع كل المواقع البيوتين ملزم في لوحة streptavidin المغلفة.
3.2 بري تطبيع
- قياس المستويات النسبية التي يتم التعبير عن البروتينات فريسة باستخدام β لاكتامازنشاط انزيم.
- أولا، تقديم سلسلة تخفيف من طاف التي تحتوي على بروتينات فريسة في PBST / 2٪ العازلة جيش صرب البوسنة. ثم تضاف 20 ميكرولتر من التخفيفات إلى 60 ميكرولتر من ميكرومتر 242 (0.125 ملغ / مل) nitrocefin حل (Calbiochem).
- نقل على الفور لوحة للقارئ لوحة microtitre أن يأخذ قياس الامتصاصية في 485 نانومتر كل دقيقة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وتظهر النتائج ممثل تطبيع فريسة في 3B الشكل.
- تركز العينات باستخدام مكثفات الطرد المركزي أو يخفف منها في جيش صرب البوسنة PBST / 2٪ لتصل إلى نشاط عتبة ~ دوران نانومول 2 -1 دقيقة من nitrocefin. عمليا، ويتحقق هذا إذا المهدرج تباع كل nitrocefin في غضون دقائق 7 ~.
4. AVEXIS الفحص الداخلي
- غسل لوحة streptavidin مغلف بالمطاط في PBST.
- أضف 100 ميكروليتر من جيش صرب البوسنة PBST / 2٪ لتصل إلى كل جيدا، واحتضان لمدة 30 دقيقة لمنع اي مواقع بروتين زائفة ملزم في كل بئر.
[نصيحة: لإزالة أي العازلة يغسل المتبقي بعد خطوات الغسيل، هو استغلالها لوحة - بقوة - على مناشف ورقية]
- إزالة حل حجب مع نفض الغبار الذكي من لوحة فوق بالوعة وإضافة 100 تطبيع المعقدة البيروكسيديز ميكرولتر الطعم أحادى إلى آبار المناسبة واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الطعم عينات من لوحة من لوحة وupturning عبها بذكاء فوق المغسلة، ويغسل 3 مرات في PBST.
- أضف 100 ميكروليتر من فريسة pentamerized تطبيع بناء على كل جيد واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، ويغسل كما في الخطوة 4.4 و إجراء واحد يغسل النهائي مع برنامج تلفزيوني فقط.
- إضافة 60 ميكرولتر من 242 ميكرومتر nitrocefin الحل (حل 5 ملغ من nitrocefin في 500 ميليلتر من DMSO، مزيج دقيق ومن ثم تمييع كذلك nitrocefin في برنامج تلفزيوني مل 40 ويمر عبر فلتر 0.22 ميكرومتر قبل إضافة إلى لوحات)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة . ويمكن ملاحظة التفاعلات الإيجابيةعين من قبل منذ والمهدرج تباع في nitrocefin الأصفر إلى اللون الأحمر. كميا من خلال قراءة الامتصاصية في 485 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. ويرد لوحة نموذجية وتحديد الكميات في الشكل. 4.
[نصيحة: ويلاحظ عادة التفاعلات الإيجابية في حدود 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على الرغم من ضرورة وضع لوحات في 4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لضمان الكشف عن كل التفاعلات المحتملة. لقد وجدنا أيضا أن nitrocefin عجلت وعيوب على البلاستيك من لوحة microtitre مثل الخدوش / بصمات يمكن أن تؤدي أحيانا إلى ايجابيات كاذبة مصطنع عند 485 نانومتر على الرغم من عدم التحلل nitrocefin علني. ولذلك يستحسن لالتقاط صور فوتوغرافية من لوحات لتسجيل بصريا دوران nitrocefin في الآبار.]
5. ممثل النتائج
ويرد مثال على طبق من ذهب ممثل فحص AVEXIS في الشكل 4. ينبغي للمرء أن نلاحظ التحلل (الأصفر إلى اللون الأحمر) من الركيزة nitrocefin فيإيجابي الآبار التحكم (كل من قبض على الفريسة الأجسام المضادة التي تتوسط فيها السيطرة وأيضا التفاعل الإيجابي السيطرة) في غضون عشر دقائق. ويلاحظ أيضا بعض التفاعلات داخل الشاشة ضمن هذا النطاق الزمني، ولكن البعض الآخر قد يستغرق وقتا أطول (بضع ساعات) على ما يبدو. عادة، ضربة معدل من حوالي 0،4-0،6٪ (أ التفاعل الإيجابي لكل التفاعلات 150-250 يجري فرزهم) هو نموذجي، اعتمادا على مكتبات بروتين يجري فرزهم.
الشكل 1. تحديد مستقبلات يجند التفاعلات عمليات الوساطة اعتراف الخلوية باستخدام AVEXIS. التخطيطي يظهر خليتين المتفاعلة (A و B) تبادل المعلومات من خلال التفاعل الذي تم بين بروتينات مستقبلات غشاء جزءا لا يتجزأ. AVEXIS هو تفاعل بروتين قابلة للمقايسة التي صممت خصيصا للتعرف على رواية مستقبلات يجند أزواج التي تتميز القوة تفاعل ضعيف جدا. المؤتلف جداوجمعت مكتبات بروتين luble تمثل ectodomain كل من مستقبلات سطح الخلية مرجع لكل من الخلايا إما pentameric يفترس β-اكتاماز الموسومة (نوع من الخلايا A) أو أحادى الطعوم البيوتين الموسومة (لنوع من الخلايا B). وpentamerisation ليفترس يزيد تركيز المحلية لectodomains لتحقيق مكسب رغابة شامل بحيث يمكن الكشف عن التفاعلات حتى عابر جدا. وتصطف مكتبة الطعم في streptavidin المغلفة لوحات تأخذ قسطا ومنهجية للتفاعل مع بروتينات فريسة. بعد غسل وجيزة، يتم الكشف عن أي يفترس التقاطها باستخدام نشاط β-اكتاماز المرتبطة فريسة.
الشكل 2. الطعم وفريسة تصميم بناء. (أ) يتم توفير بروتين الفئران مستقبلات Cd200 كمثال على كيفية تحديد ectodomains كامل للبروتينات مستقبلات الخلية السطحية وتهدف إلى جعل كل من الاشعال الطعمويبني فريسة التعبير. ويبين تسلسل بروتين [كدنا] وترجم من الببتيد إشارة N-محطة للغشاء تمتد المنطقة عبر الغشاء من الفئران Cd200. تم تصميم التمهيدي معنى لتشمل تقييد NOTI 5 'موقع الانزيم والأمثل تسلسل كوزاك تليها 25 قواعد للتسلسل تطابق تام لتسلسل [كدنا] Cd200. التمهيدي العقاقير يحتوي على موقع زقاق و 25 قواعد للتسلسل تطابق تام يقع المنبع مباشرة من بقايا ectodomain اقتطاع المحدد. للحفاظ على ectodomain في إطار مع العلامة الفئران +4 Cd4d3، ينبغي أن تترجم موقع زقاق كما الغليسين علاء برو. (ب) تمثيل تخطيطي من الطعم وبنيات التعبير فريسة. كل يحتوي على مستقبلات ectodomains يحيط بها NOTI ومواقع ASCI وCd4d3 العلامة +4. والطعم السام تحتوي على تسلسل الببتيد C-المحطة التي يمكن monobiotinylated تحديدا cotransfection مع البلازميد تعبر عن انزيم يفرز البيرة. يتم اتباع يفترس حسب التسلسل pentamerisationمن مصفوفة البروتين غضروف oligomeric (شركات) وانزيم β-اكتاماز.
الشكل 3. التطبيع من الطعم والبروتينات فريسة. (أ) أمثلة الممثل التطبيع الطعم. تم الكشف عن سلسلة تخفيف من أربعة أنواع مختلفة من الطعم supernatants dialysed بواسطة ELISA ان استخدام أجسام مضادة لمكافحة CD4 علامة وحيدة النسيلة. وأعرب عن الطعم 4 على مختلف المستويات 1> 2> 3> 4. يجب تطبيع الطعوم إلى مستوى عتبة أن يشبع المواقع البيوتين ملزم في كل بئر. ويمكن تخفيفه الطعم عالية أعرب للحفاظ على البروتين (على سبيل المثال يمكن أن تضعف الطعم 1 ~ 1:100)، وتتركز سيئة الطعم وأعرب. ويلاحظ أحيانا قراءات انخفضت في التخفيفات منخفضة في بعض الطعوم (مثل الطعم 2) الذي يعزى إلى وجود unconjugated مد البيوتين نظرا لغسيل الكلى غير مكتملة. (ب) والمستويات التي فريسة البروتينات هي السابقينوضغطت كميا باستخدام معدل التحلل من ركيزة β لاكتاماز، nitrocefin. في المثال المعروض، وأعرب عن يفترس ثلاثة في مستويات مختلفة: فريسة 1> 2> 3. يجب تطبيع يفترس إلى نشاط من ~ 2 -1 دقيقة نانومول، وهو ما يقابل لإكمال التحلل من nitrocefin نانومول 14.5 في الدقائق 7 ~ (على سبيل المثال فريسة 1). ينبغي أن تتركز يفترس أخرى في هذا المثال قبل استخدامها في فحص.
الشكل 4. نتائج ممثل AVEXIS الفرز. (أ) صورة طبق من ذهب ممثل فحص AVEXIS. يتم بحثها بروتين فريسة مقابل 41 الطعوم المختلفة، ويتم الكشف عن التفاعل الإيجابي في E2 جيدا. الضوابط التي استخدمت في لوحات فحص ما يلي: أ المعقدة البيروكسيديز مكافحة CD4 الأجسام المضادة للقبض على كل من البروتين فريسة إضافة إلى البئر (G6)، وتفاعل التحكم: جرذ Cd200 فريسة المستخدمة (الطعم)-Cd200R (فريسة) مع Cd200R في تخفيف عتبة (H3)، 1:10 (H4) و1:100 (H5). وكانت الرقابة السلبية: أ Cd4d3 +4 الطعم وبحث مع يجري فحص البروتين فريسة (H1) وفريسة Cd200R (H2). (ب) القياس الكمي للقيم الامتصاصية من نفس الشاشة التي أجريت في ثلاث نسخ. نقاط البيانات يعني ± SD.
Discussion
عندما لاحظ الخلايا الحية في الجسم الحي، والأغشية البلازما من معرض السلوكيات ديناميكية للغاية: مد وعمليات غشاء التراجع لأنها الاتصال والتواصل مع 2 جيرانهم. وقد تطورت التفاعلات الجسدية بين بروتينات مستقبلات غشاء جزءا لا يتجزأ من الذي توسط في العديد من هذه الاتصالات ان يكون ضعيفا جدا بحيث تسمح لهذا السلوك متحركة جدا. وتشير التقديرات إلى أن قوة التفاعل أحادى على أنه ضعيف إلى 50 ميكرومتر يمكن أن يكون كافيا لدفع التفاعل العفوي بكثافة مستقبلات الفسيولوجية (9) الذي يجعل الكشف عن التفاعلات رواية صعبة للغاية 2،10. طريقة AVEXIS الموصوفة هنا يوفر طريقة حساسة للكشف عن البروتين خارج الخلية عابر: تفاعلات البروتين التي يمكن تنفيذها بطريقة متدرجة مع انخفاض معدل إيجابية كاذبة. في حين وضعت أساليب للتحجيم أخرى للكشف عن التفاعلات خارج الخلية 11-15،ميزة واحدة من AVEXIS هي التي تم كميا المعلمات التجريبية مثل الطعم والأنشطة فريسة للكشف عن حتى أضعف من التفاعلات (ر 1/2 ≤ 0.1 ق) مع الحفاظ على انخفاض معدل إيجابية كاذبة 3. وبالإضافة إلى ذلك، مكنت إعداد نموذج مبسط ومتين إجراءات هذا الفحص إلى أن تنفذ على نطاق أوسع بكثير من فحوصات أخرى والتي وصفناها في الآونة الأخيرة على شاشة تفاعل منهجي تقدر بأكثر من التفاعلات المحتملة 16500 ~ 16.
لا يمكن أن يؤديها للفحص في أي من البروتين الذي كان من الممكن للتعبير عن ذوبان قطعة بروتين المؤتلف. وهذا يشمل ذلك البروتينات التي تحتوي على الببتيد إشارة N-محطة مثل النوع الأول، GPI مرتبطة وتفرز بروتينات. لقد قمنا بتصميم مؤخرا مجموعة من النواقل التي تمكن الآن لنا للتعبير عن نوع من البروتينات الثاني والطعم 17. الفحص ليست عادة مناسبة للبروتينات غشاء المتعددة الدخول مثل نقل أيونق أو مضخات لأنها من غير المرجح أن تكون مطوية بشكل صحيح خارج سياق غشاء البلازما. وقد طبقنا هذا على مجموعة متنوعة من نظم مختلفة وأعربوا عن بنجاح البروتينات خارج الخلية من الزرد 3،16،18، والبشرية، والفأرة P. المنجلية لشاشات التفاعل.
من حيث الموارد اللازمة لانشاء شاشة AVEXIS، وجدنا ان عنق الزجاجة أهمية هو اختيار، والبناء، والتسلسل الكامل للالبلازميدات التعبير. ويمكن في هذا الجانب من أسلوب يستغرق فترة تصل الى عام لجعل ~ 100 الطعم والبنى فريسة، ولكن، مع انخفاض تكاليف التركيب الجيني، نؤيد الآن تجاريا الاستعانة بمصادر خارجية في هذا الجانب من المشروع. نظام التعبير الثدييات جنبا إلى جنب مع كبير يهز الأنسجة حاضنة الثقافة (ونحن استخدام خلية INFORS Multitron HT) تمكن الباحث وحيد للتعبير عن وتطبيع ما يصل الى 100 ~ الطعم والبروتينات فريسة في الشهر. مرة واحدة ويتم إنتاج البروتينات وتطبيع، قcreening للتفاعل سريع مع ما يصل إلى 12 لوحات 96-جيدا يتم معالجتها بشكل ملائم في اليوم الواحد. المعدات مفصل إلا أننا قد وضعت لتسهيل انتاج هذا العدد الكبير من البروتينات هو هواء مضغوط يحركها المكبس الذي يستخدم لتمرير ما يصل الى خمسة supernatants من خلال مرشح 0.22μm بشكل متواز.
الطبقة الرئيسية من التفاعلات التي قد غاب بالمقارنة مع التفاعلات المتوقعة من الأدب (كاذبة سلبيات) هي التفاعلات مقتصر على المطابق، على الرغم من أن يمكن الكشف عن بعض من هذه التفاعلات 3. في الحالات التي لم يتم الكشف عن التفاعلات المتوقعة، نعتقد أن هذا يرجع إلى تشكيل التفاعلات مقتصر على المطابق من البروتينات فريسة (أ فريسة "اخفاء" التأثير) الذي يحول دون مزيد من التفاعل ثم مع البروتينات الطعم يجمد. التردد الذي يتم الكشف عن التفاعلات يعتمد على محتوى مكتبة بروتين يجري فرزهم. كدليل للقارئ، وشاشة من> 30، نتج 000 التفاعلات داخل الفصيلة المناعي الزرد في 188 ايجابيات - تردد 0.6٪ 3،16،18. شيك سريع جدا التي يمكن القيام بها للتحقق من أي إصابات إيجابية تتمثل في تحديد ما إذا كان يمكن الكشف عن تفاعل التوجهات في الطعم والفريسة على حد سواء وهذا هو، ويمكن الكشف عن التفاعل نفسه بغض النظر عن ما إذا كانت ملزمة البروتينات موجودة إما الطعم أو فريسة. كلما لاحظنا هذا السلوك تبادل، وبعد ذلك تم الربط أظهرت أن تكون محددة من خلال إظهار ملزم تشبع مباشرة لتنقية البروتينات باستخدام سطح صدى مأكل. وينبغي التأكيد على أن زيادة الطمع، لأننا ملزم من قبل pentamerising مصطنع البروتينات فريسة، ونحن لا نعتبر فحص مناسبة للمقارنة كميا قوة التفاعل. للحصول على المعلمات ملزم البيوفيزيائية من التفاعلات نستخدم البروتينات أحادى وسطح صدى مأكل. أخيرا، مرة واحدة وقد تم التعرف على التفاعل، ومرحباغ طبيعة الإنتاجية للفحص يجعل من السهل نسبيا على التكيف مع الفحص للكشف عن المواد الكاشفة مثل الأجسام المضادة أو الجزيئات الصغيرة التي تعمل على منع التفاعل.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل عدد يلكوم ترست منحة [077108] منحت لGJW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
| Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
| SA-coated microtitre plates | Nalge Nunc international | 734-1284 | |
| OX68 antibody | AbD Serotec | MCA1022R | |
| Dialysis tubing | Pierce, Thermo Scientific | PN68100 | |
| Polymyxin B | Sigma-Aldrich | P4932 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639-5G | |
| Substrate-104 | Sigma-Aldrich | 1040-506 | |
| Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius AG | VS2002 | |
| 0.22 μm filters | Nalge Nunc international | 190-2520 |
References
- Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome research. 18, 622-622 (2008).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, e9-e9 (2002).
- Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G. Improved Prediction of Signal Peptides: SignalP 3.0. Journal of molecular biology. 340, 783-783 (2004).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. Journal of molecular biology. 305, 567-567 (2001).
- Brown, M. H., Barclay, A. N. Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4 for ligand analysis. Protein engineering. 7, 515-515 (1994).
- Wright, G. J., Puklavec, M. J., Willis, A. C. Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes a novel receptor on macrophages implicated in the control of their function. Immunity. 13, 233-23 (2000).
- Dustin, M. L., Golan, D. E., Zhu, D. M. Low affinity interaction of human or rat T cell adhesion molecule CD2 with its ligand aligns adhering membranes to achieve high physiological affinity. The Journal of biological chemistry. 272, (1997).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society transactions. 38, (2010).
- de Wildt, R. M., Tomlinson, I. M., Ong, J. L. Isolation of receptor-ligand pairs by capture of long-lived multivalent interaction complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (2002).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129, 55-55 (2010).
- Urech, D. M., Lichtlen, P., Barberis, A. Cell growth selection system to detect extracellular and transmembrane protein interactions. Biochimica et biophysica acta. 1622, 117-117 (2003).
- Voulgaraki, D., Mitnacht-Kraus, R., Letarte, M. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115, 337-337 (2005).
- Wojtowicz, W. M., Wu, W., Andre, I. A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains. Cell. 130, 1134-1134 (2007).
- Martin, S., Sollner, C., Charoensawan, V. Construction of a Large Extracellular Protein Interaction Network and Its Resolution by Spatiotemporal Expression Profiling. Mol. Cell. Proteomics. 9, 2654-2654 (2010).
- Crosnier, C., Bustamante, L. Y., Bartholdson, S. J., Bei, A. K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum. Nature. 480, 534-537 (2011).
- Sollner, C., Wright, G. J. A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors. Genome biology. 10, R99-R99 (2009).
