AVEXIS é uma alta taxa de ensaio interação proteína desenvolvida para a tela de forma sistemática para novas extracelular do receptor-ligante pares envolvidos em processos de reconhecimento celular. Ele é projetado especificamente para detectar interações protéicas transitórios que são difíceis de identificar com outras abordagens de alto rendimento.
Proteína extracelular: interações entre proteínas secretadas ou de membrana ancoradas proteínas são fundamentais para a coesão de iniciar a comunicação intercelular e garantir dentro de organismos multicelulares. Proteínas predito para formar interacções extracelulares são codificados por aproximadamente um quarto de genes humanos 1, mas apesar da sua importância e abundância, a maioria destas proteínas não têm documentado parceiro de ligação. Primeiramente, isto é, devido à sua intratabilidade bioquímica: proteínas de membrana-incorporados são difíceis de solubilizar na sua conformação nativa e conter estruturalmente importantes modificações pós-tradução. Além disso, as afinidades de interação entre proteínas receptoras são geralmente caracterizadas por força de interação extremamente baixas (meia-vida <1 segundo) que impossibilitam sua detecção com muitos comumente utilizados métodos de alto débito 2.
Aqui, nós descrevemos um ensaio, AVEXIS (avidez de base EXtracellular Interação Tela) que supera estes desafios técnicos que permitam a detecção de interações protéicas muito fraco (t 1/2 ≤ 0,1 seg), com uma baixa taxa de falsos positivos 3. O ensaio é executado geralmente num formato de alta taxa de transferência, para permitir o rastreio sistemático de muitos milhares de interacções em um formato conveniente de microtitulação de placa (Fig. 1). Baseia-se na produção de bibliotecas solúveis de proteínas recombinantes que contêm os fragmentos ectodomínio de receptores de superfície celular ou proteínas secretadas dentro do qual a tela para interacções, portanto, esta abordagem é adequada para o tipo I, tipo II, a GPI-linked receptores da superfície celular e secretada proteínas, mas não para as proteínas de membrana multipass tais como canais de iões ou transportadores.
As bibliotecas de proteínas recombinantes são produzidos usando um sistema de expressão conveniente e de alto nível de mamífero 4, para assegurar que as modificações pós-tradução importantes, tais como glycosylação e ligações dissulfeto são adicionados. Expressas proteínas recombinantes são secretados para o meio e produzida em duas formas: uma isca biotinilado, que pode ser capturado em uma fase de estreptavidina-revestido sólido adequado para o rastreio, e uma enzima pentamerised-etiquetados presa (β-lactamase). A isca e as proteínas são apresentados presas umas às outras de uma forma binária para detectar interacções directas entre eles, semelhantes a um ELISA convencional (Fig. 1). O pentamerisation das proteínas no presa é conseguido através de uma sequência peptídica da proteína matriz da cartilagem oligomérico (COMP) e aumenta a concentração local de ectodomínios proporcionando assim ganhos de avidez significativas para permitir interacções mesmo muito transientes a ser detectado. Normalizando as actividades de ambos isca e presa a níveis predeterminados antes de rastreio, que mostraram que as interacções com monoméricos meias-vidas de 0,1 seg pode ser detectada com baixas taxas de falsos positivos 3.
Quando células vivas são observados in vivo, suas membranas plasmáticas exibem comportamentos altamente dinâmicos: ampliação e processos de membrana de retracção como contatar e se comunicar com seus 2 vizinhos. As interacções físicas entre as proteínas de membrana incorporados receptores que medeiam muitos destes contactos evoluíram para ser extremamente fraca, de modo a permitir que este comportamento altamente móveis. Estimou-se que as forças de interacção monoméricas como fraco como 50 uM poderia ser suficiente para impulsionar as interacções espontâneas em densidades de receptores fisiológicos 9, o que torna a detecção de interacções novos extremamente desafiantes 2,10. O método AVEXIS aqui descrito fornece um método sensível para a detecção de proteína extracelular transitória: interações protéicas que podem ser implementadas de uma forma escalável com uma baixa taxa de falsos positivos. Enquanto outros métodos escaláveis têm sido desenvolvidos para detectar interacções extracelulares 11-15,Uma vantagem de AVEXIS é que os parâmetros experimentais, tais como a isca e actividades de presas foram quantificados para detectar mesmo os mais fracos das interacções (t 1/2 ≤ 0,1 s), mantendo uma baixa taxa de falsos positivos 3. Além disso, os procedimentos de preparação simplificados e robustos amostra permitiram este ensaio a ser implementado em uma escala muito maior do que outros ensaios e recentemente descrita uma tela de interação sistemática, totalizando mais de 16.500 potenciais interacções do ~ 16.
O ensaio pode ser realizado em qualquer proteína para a qual é possível expressar um fragmento de proteína recombinante solúvel. Este inclui, portanto, as proteínas que contêm um péptido de sinal N-terminal, tal como o tipo I, IGP-ligados e secretada proteínas. Recentemente, concebemos um conjunto de vetores que agora nos permitem expressar proteínas do tipo II como iscas 17. O ensaio não é geralmente adequado para proteínas de membrana, tais como multipass transportador de iõess ou bombas, uma vez que não são susceptíveis de ser correctamente dobrada fora do contexto de uma membrana plasmática. Temos aplicado este a uma variedade de diferentes sistemas e com êxito expressaram proteínas extracelulares a partir de peixe-zebra 3,16,18, humano, rato e P. falciparum para telas de interação.
Em termos de os recursos necessários para configurar uma tela AVEXIS, nós descobrimos que um gargalo significativo é a selecção de construção, e sequenciação completa dos plasmídeos de expressão. Este aspecto do método pode levar até um ano para fazer ~ isca 100 e construções de presa, no entanto, com o custo decrescente de síntese de genes, que agora favorecer comercialmente terceirizando este aspecto do projecto. O sistema de expressão de mamífero em conjunto com uma grande agitação de cultura de tecidos incubadora (usamos um INFORS HT celular Multitron) permite um único pesquisador para expressar e normalizar até ~ 100 isca e proteínas de presas de um mês. Uma vez que as proteínas são produzidas e normalizados, screening para interacções é rápida, com até 12 placas de 96 poços a ser convenientemente transformados por dia. O equipamento apenas por medida que têm desenvolvido para facilitar a produção de um número tão grande de proteínas é um comprimido pistão de ar de propulsão, que é utilizada para passar até cinco sobrenadantes através de um filtro 0.22μm em paralelo.
A classe principal de interacções que podem ser perdidas, quando comparado com as interacções esperados a partir da literatura (falsos negativos) são interacções homofílico, embora alguns destes interacções podem ser detectados 3. Nos casos em que as interacções esperados não são detectados, acreditamos que isto é devido à formação de interacções homofílico pelas proteínas de presa (uma presa "mascaramento" efeito) que, em seguida, impede interacções adicionais com proteínas de isco imobilizadas. A frequência com que as interacções são detectados depende do conteúdo da biblioteca de proteína a ser rastreada. Como um guia para o leitor, uma tela de> 30, 000 interacções dentro da superfamília das imunoglobulinas do peixe-zebra resultou em 188 positivos – uma frequência de 0,6% 3,16,18. Uma verificação muito rápida que pode ser realizada para verificar todos os acessos positivos é para determinar se a interacção pode ser detectada em ambas as orientações isca-presa, isto é, a mesma interacção pode ser detectada independentemente do facto de as proteínas de ligação estão presentes tanto como isco um ou uma presa. Sempre que têm observado este comportamento reciprocidade, a ligação foi subsequentemente demonstrado ser específico, demonstrando ligação saturável directa de proteínas purificadas utilizando ressonância plasmon de superfície. Ressalte-se que pelo fato de aumentar a avidez de ligação por artificialmente pentamerising as proteínas presas, nós não consideramos o teste apropriado para comparar quantitativamente força de interação. Para obter biofísicos parâmetros de ligação de interações que usamos proteínas monoméricas e ressonância plasmon de superfície. Finalmente, uma vez uma interacção tenha sido identificada, o oinatureza rendimento gh do ensaio torna relativamente fácil de se adaptar o ensaio a tela para reagentes tais como anticorpos ou moléculas pequenas que bloqueiam a interacção.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Wellcome número conceder confiança [077108] atribuído ao GJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |