AVEXIS小说外,受体 – 配体对细胞识别过程中所涉及的系统屏幕开发的一种高通量蛋白质相互作用检测。它是专门用于检测短暂的蛋白质相互作用,难以确定使用其他高通量方法。
胞外蛋白:蛋白质分泌或栓膜蛋白之间的相互作用是同时启动间的沟通,并确保在多细胞有机体的凝聚力的关键。蛋白质预计将形成约四分之一的人类基因1编码外的相互作用,但尽管其重要性和丰富,这些蛋白质大多数没有记载约束力的合作伙伴。这主要是由于其生化棘手:膜嵌入蛋白是难以solubilise在其天然构象,并包含结构最重要的翻译后修饰。此外,受体蛋白之间的相互作用的亲和力的特点往往是极低的互动优势,解除他们的检测与许多常用的高通量方法2(半衰期<1秒)。
在这里,我们描述一个试验,AVEXIS(基于亲和力的细胞外LAR互动屏幕),克服这些技术挑战,使检测非常微弱的蛋白质相互作用,具有较低的假阳性率3(T 1/2≤0.1秒)。通常实施该法在高通量格式,使成千上万在一个方便的微孔板格式的相互作用(图1)系统的筛选。它依赖于可溶性细胞表面的受体或分泌的蛋白质内筛选相互作用的胞外片段重组蛋白库包含的生产;因此,这种做法是合适的类型,II型,GPI相连的细胞表面受体和分泌蛋白质,但不为多通道的膜蛋白,如离子通道或转运。
重组蛋白库是使用一个方便的和高层次的哺乳动物表达系统 ,以确保重要的翻译后修饰,如glycosyla添加TION和二硫键。表达的重组蛋白分泌到中期和生产有两种形式:可上的链亲和素涂层的固相筛选适合捕获生物素诱饵,和pentamerised酶标记(β-内酰胺)的猎物。诱饵和猎物的蛋白质是彼此在二进制的方式来检测它们之间的直接相互作用,类似于传统的酶联免疫吸附试验(图1)。在猎物的蛋白质pentamerisation是通过从肽序列的软骨寡聚基质蛋白(COMP)和局部浓度增加,从而提供了大量的亲和力收益,使被检测到即使非常短暂的相互作用的胞外区。诱饵和猎物筛选之前预定水平的活动正常化,我们已经表明,单体的半衰期为0.1秒的相互作用可以用较低的假阳性率检测。
当体内观察到活细胞的细胞膜表现出高度的动态行为:扩展和回缩膜过程中,为他们联系和沟通,与他们的邻居2。膜嵌入的受体蛋白之间的物理相互作用,调解这些接触很多已经发展到极度虚弱,以便允许这个高度能动的行为。据估计,单体50μM弱相互作用的优势可能足以推动在生理上的受体密度9,这使得检测新颖的互动,极具挑战性的2,10自发的相互作用。 AVEXIS这里描述的方法提供了一个敏感的方法检测瞬态胞外蛋白:蛋白具有较低的假阳性率,可以在一个可扩展的方式实现的交互。而其他可伸缩的方法已发展到检测外的相互作用11-15一AVEXIS优势是诱饵和猎物的活动,如实验参数已被量化,甚至检测最弱的相互作用(T 1/2≤0.1秒),同时保持较低的假阳性率3。此外,精简和健壮的样品制备程序已经启用此法可实现更大的规模上比其他实验,我们最近描述了系统的互动屏幕,共计超过16500 16〜潜在的相互作用。
该法可以对任何蛋白质,它是可能的表达可溶性重组蛋白片段。因此,这包括蛋白质,含有如类型我的GPI挂钩和分泌的蛋白质N-末端的信号肽。最近,我们设计了一个载体,现在让我们来表达II型蛋白作为诱饵17套房。该法一般不适合多通道的膜蛋白,如离子转运或泵,因为它们是不可能被正确折叠外质膜中。我们已申请到各种不同的系统,并已成功地表达胞外蛋白3,16,18斑马鱼,人类,小鼠和P.恶性的互动屏幕。
设立AVEXIS屏幕所需的资源方面,我们已经找到了一个重要的瓶颈是选择,建设,充分表达质粒测序。这方面的方法,可以采取长达一年〜100诱饵和猎物的结构,然而,我们现在用的基因合成降低成本,有利于商业这方面的项目外包。大摇组织培养孵化器(我们使用一个INFORS的高温Multitron细胞)的哺乳动物表达系统,使一个单一的研究员,表达和正常化〜100诱饵和猎物的蛋白质一个月。一旦生产和规范化的蛋白质的互动creening是快速板被方便地每天处理高达12 96。只有定制的设备,我们已经制定促进生产如此大量的蛋白质,是压缩空气驱动活塞,这是用来传递五上清,0.22μm的过滤器通过并行。
上课的时候相比,预计从文学(假阴性)的相互作用可能错过的相互作用主要是同种的相互作用,尽管这些相互作用可以检测3。在没有检测到预期的相互作用的情况下,我们相信,这是由于猎物蛋白(猎物“掩蔽效应”)的同种相互作用的形成,从而防止进一步固定化诱饵蛋白相互作用。相互作用检测的频率取决于被筛选蛋白质库的内容。作为一个读者的指南,屏幕> 30,000个斑马鱼的免疫球蛋白超家族内的相互作用,导致188正片- 3,16,18频率为0.6%。可以进行验证任何积极的命中是非常迅速的检查,以确定是否相互作用可以检测两个诱饵猎物方向;即可以相同的相互作用被发现不论是否结合蛋白作为诱饵或猎物。每当我们观察到了这种回报行为,随后被绑定已证明是由证明直接利用表面等离子体共振的纯化蛋白饱和约束力的具体。应当强调的,因为我们增加人工pentamerising猎物蛋白结合的亲和力,我们不考虑适合的互动优势定量比较分析。为了获得结合生物物理参数,我们使用单体蛋白质和表面等离子体共振的相互作用。最后,一旦互动已经确定,您好检测GH吞吐量性质使得它比较容易适应的检测试剂,如抗体或小分子阻止互动屏幕。
The authors have nothing to disclose.
支持这项工作是由威康信托基金资助[077108]荣获GJW。
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |