Summary
AVEXIS er et højt gennemløb protein-interaktion assay udviklet til systematisk screening for hidtil ukendte ekstracellulære receptor-ligand-par involveret i cellulære genkendelse processer. Det er specielt designet til at detektere transiente proteininteraktioner, der er vanskelige at identificere ved hjælp af andre højt gennemløb fremgangsmåder.
Abstract
Ekstracellulært protein: protein-interaktioner mellem secerneres eller membran-bundne proteiner er kritiske for begge initiering intercellulær kommunikation og sikre sammenhæng inden multicellulære organismer. Proteiner forventes at danne ekstracellulære interaktioner kodet af cirka en fjerdedel af menneskelige gener 1, men på trods af deres betydning og overflod, har de fleste af disse proteiner ingen dokumenteret bindende partner. Primært, skyldes deres biokemiske intractability: membran-indlejrede proteiner er vanskelige at solubilisere i deres native konformation, og som indeholder strukturelt vigtige posttranslationelle modifikationer. Desuden er samspillet tilhørsforhold mellem receptorproteinerne ofte kendetegnet ved ekstremt lave interaktion styrker (halveringstider <1 sekund) til hinder for deres opdagelse med mange almindeligt anvendte high throughput metoder 2.
Her beskriver vi en analyse, AVEXIS (Avidity-baserede EXtracelluLAR Interaktion skærm), der overvinder disse tekniske udfordringer muliggør påvisning af meget svage proteininteraktioner (t 1/2 ≤ 0,1 sek) med en lav falske positiver 3. Assayet gennemføres normalt i et højt gennemløb format at muliggøre systematisk screening af tusinder af interaktioner i en bekvem mikrotiterplade format (fig. 1). Den er afhængig af produktionen af opløselige rekombinante protein biblioteker, der indeholder ectodomænet fragmenter af celleoverfladereceptorer eller secernerede proteiner, til at screene for interaktioner og derfor er denne fremgangsmåde er egnet til type I, type II, GPI-linked celleoverfladereceptorer og secerneret proteiner, men ikke for MultiPass membranproteiner, såsom ionkanaler eller transportører.
Det rekombinante protein biblioteker fremstilles ved anvendelse af en bekvem og højt niveau mammalia-ekspressionssystem 4, for at sikre, at vigtige posttranslationelle modifikationer, såsom glycosylation og disulfid obligationer er tilføjet. Udtrykte rekombinante proteiner udskilles i mediet og fremstillet i to former: en biotinyleret lokkemad, som kan indfanges på en streptavidin-overtrukket fast fase der er egnet til screening, og en pentamerised enzym-mærkede (β-lactamase) bytte. Lokkemaden og prey-proteiner præsenteres til hinanden i en binær måde at detektere direkte interaktioner mellem dem, der ligner en konventionel ELISA (fig. 1). Den pentamerisation af proteinerne i bytte opnås ved en peptidsekvens fra brusk oligomere matrix protein (COMP) og øger den lokale koncentration af de ektodomæner hvorved der opnås betydelige aviditet gevinster til at selv meget kortvarige interaktioner, der skal detekteres. Ved at normalisere aktiviteter både agn og bytte til forudbestemte niveauer forud for screening, har vi vist, at interaktioner med monomere halveringstider på 0,1 sek kan påvises med lave falske positive satser 3.
Protocol
1. Udarbejdelse af et bibliotek af Bait og Prey Plasmid-ekspressionsvektorer
- Udarbejde en liste over celleoverfladereceptor og secernerede proteiner af interesse, der skal screenes for interaktioner og hente deres sekvenser fra et egnet proteinsekvens-database. De fleste proteiner, som indeholder en N-terminal sekretorisk signalpeptid er egnede (navnlig type I, GPI-bundne og secernerede proteiner). Typisk vil et protein familie (f.eks immunoglobulin-superfamilien eller alle receptorer begrænset til en specifik celletype, såsom erythrocyt) vælges.
- Bestemme omfanget af de ekstracellulære regioner ved at identificere placeringen af signalpeptidet og transmembrane region under anvendelse af protein-funktion forudsigelse software. Vi bruger typisk SignalP v3.0 5 og TMHMM v2.0 6.
- Design primersæt at amplificere hele ectodomænet fragmentet for hver receptor. Vi har en pakke med lokkemad, og bytte vektorer der er egnede til dette formål, hvilket er enudligningsberettiget fra Addgene ( http://www.addgene.org/~~V ). Designe sense-primeren omkring startmethioninet omfatter et NotI restriktionsenzym-site, og en optimal Kozak-sekvens; dette efterfølges af 25 basepar af eksakt match gen-specifikke sekvens (fig. 2A).
- Designe antisense primeren at trunkere type I receptor-proteiner lige før den forudsagte transmembrane region, således at udtrykke hele ectodomænet som et opløseligt rekombinant protein. Omfatter en AscI restriktionssted i denne primer som derefter omsættes i ramme til en C-terminal rotte Cd4d3 4 proteinmærke 7 (fig. 2A).
- Opformere ectodomænet fragmenterne fra alle gener ved anvendelse af disse primere og klone dem i lokkemad eller bytte vektor. Vi undertiden finde det nyttigt først at klone dem i shuttlevektorerne før subkloning i en passende pattedyrsekspressionsvektor, bruger vi et derivat af pTT3 vektor 3,4. Både agn og bytte vektorer contain C-terminale proteinmærker som følger (fig. 2B).
- Lokkemad: Et mærke indeholdende domæner 3 og 4 af rotte-CD4 (Cd4d3 4) protein efterfulgt af en peptidsekvens, som er et substrat for E. coli BirA-enzymet og kan derfor monobiotinylated på en specifik lysinrest (fig. 2B) . Den Cd4d3 4 tag genkendes af OX68 monoklonale antistof og anvendes til at kvantificere ekspressionen af bait-proteiner ved hjælp af ELISA. Lokkemaden proteiner er derfor monomere og monobiotinylated. Yderligere lokkemad proteinvektorer hvor biotinylatable peptidet er erstattet med en 6-His-tag til oprensning er tilgængelige.
- Byttedyr: De byttedyr også indeholde en rotte Cd4d3 4 tag, efterfulgt af en peptidsekvens fra rotte brusk oligomere matrix protein (COMP) og en C-terminal β-lactamase-enzymet. Den COMP peptid sikrer byttet former pentamerer gang udtrykt (Fig. 2B).
2. Bytte-og Bait-proteinekspression
Vi anvenderen bekvem højniveauekspression system ved hjælp af suspension kultur HEK293E cellelinie 4 til fremstilling af vores protein biblioteker, men enhver mammal ekspression bør være egnet. Et kommercielt tilgængeligt alternativ er Freestyle system. Celler dyrket rutinemæssigt på et rystebord (125 rpm) ved 37 ° C, 5% CO2 ved 70% relativ fugtighed. Både positive og negative kontrolprøver proteiner skal også komme til udtryk. Rotte Cd4d3 4 tag-only-fragmentet fås både som madding og bytte og er egnede negative kontroller. Tilsvarende, agn og bytte vektorer, der koder for en positiv kontrol er til rådighed (Addgene), vi typisk bruger rotte CD200-Cd200R interaktion 8.
- Pode HEK293E-celler dagen før transfektion med en tæthed på 2,5 x 10 5 celler ml-1. Vi rutinemæssigt dyrke cellerne i volumener på 50 ml i Freestyle293 medier efter fabrikantens anvisninger. For at sikre en effektiv biotinylering supplere tHan cellekulturmedium anvendes til fremstilling af bait-proteiner med D-biotin til en slutkoncentration på 100 uM. Medium, der anvendes til at udtrykke prey-proteiner ikke behøver at blive suppleret med yderligere D-biotin.
- Den følgende dag, transficere celler under anvendelse af en egnet transfektioner reagens (f.eks 293fectin). Anvendelse 25 ug af lokkemad eller byttedyr plasmidkonstruktioner at transficere en 50 ml kultur. At fremstille de biotinylerede lokkemad, co-transficere det plasmid, der koder for lokkemaden konstruktion med et plasmid, der koder for en secerneret form af E. coli protein-biotin-ligase ( BirA), som er tilgængelig fra Addgene. Co-transfektion af lokkemad plasmider ved et 10:1 forhold (2,5 ug) af plasmidet, der koder for secernerede BirA-proteinet.
- Høst kulturer fem dage efter transfektion ved først pelletering af cellerne ved centrifugering ved 3000 x g i 20 minutter efterfulgt af filtrering af supernatanten gennem et 0,22 um filter.
[Tip: Bait og bytte proteins skal opbevares ufortyndet ved 4 ° C og som en generel retningslinie bør anvendes inden for et år. Tilsættes bacteriostatics såsom 50 ug / ml polymyxin B sulfater eller 10 mM NaN3 for at forhindre bakteriel kontaminering af supernatanterne.]
3. Normalisering af Bait og Prey Prøver
Et af de vigtigste træk ved AVEXIS assayet er, at fordi de rekombinante proteiner er secerneret de kan fortyndes eller koncentreres (normaliseret) i en opstillet tærskelværdier aktiviteter inden anvendes i assayet. Vi har fundet, at de niveauer, hvor de rekombinante proteiner udtrykkes omfatter en lang række - op til 4 størrelsesordener - og så normaliseringstrin reducerer antallet af falske positive i skærmene.
3,1 Bait normalisering
Bemærk: Ukonjugeret D-biotin skal fjernes fra mediet (typisk ved dialyse), da den vil konkurrere med det biotinylerede Bait-protein om binding til streptavidin bindingssteder.
- Overfør agn supernatanter i dialyserør, etiketter klemme sikkert og dialyseres ekstensivt mod en egnet puffer, såsom PBS for at fjerne frit biotin.
[Tip: Vi har fundet, at tilstrækkelig dialyse normalt opnås i 6 x 50 ml lokkemad supernatanter mod et volumen på 4,5 liter PBS med 4 ændringer over en 24 timers periode. Utilstrækkelig dialyse kan observeres ved en inhibering af proteinbinding ved lave fortyndinger under lokkemaden normalisering trin (fig. 3A).
- Udfør en ELISA til at bestemme de relative niveauer, ved hvilke agn proteiner udtrykkes. Fremstille en fortyndingsserie af de biotinylerede bait-proteiner og fange dem på en streptavidin-overtrukket mikrotiterplade. Anvende rotte Cd4d3 4 mærke til påvisning og kvantificering af de indfangede bait-proteiner under anvendelse af et monoklonalt antistof (OX68). Koncentrerede eller fortyndede bait-proteiner til det minimum, der kræves for at mætte alle Bioti bindingssteder i brønden af en streptavidin-overtrukket plade.
- Blokere brøndene i en streptavidin-overtrukket plade med phosphatpufret saline/0.1% Tween-20 (PBST) / 2% bovint serumalbumin (BSA) i 15 minutter.
- I en separat plade, foretage en fortyndingsserie (fire 1:3 fortyndinger er normalt tilstrækkelige) af bait-proteiner i PBST / 2% BSA og overførsel til brønde af en streptavidin-overtrukket plade. Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaskes 3x i PBST. Tilsæt 100 pi 2 ug / ml muse-anti-rotte Cd4d3 4-IgG (OX68) inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaskes 3x i PBST. Tilsæt 100 pi anti-muse-alkalisk phosphatase ved 1:5000 fortynding i PBST / 2% BSA og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaskes 3x i PBST, og udføre en afsluttende vask i PBS for at fjerne eventuel resterende detergent. Tilsæt 100 pi af 1 mg / ml substrat 104 i diethanolaminbuffer (10% diethanolamin (v / v), 0,5 mM MgCl2, 10 mM NaN3, pH9.8, opbevares beskyttet fra lys i 4° C).
- Efter en time absorbansen ved 405 nm. Repræsentative agn normaliseringsfaktorer Resultaterne er vist i figur 3A.
- Bait-proteiner der er udtrykt på niveauer, der er tilstrækkelige til at mætte alle biotin-bindende steder af en streptavidin-overtrukket plade, når det anvendes ufortyndet, bør koncentreres under anvendelse Vivaspin koncentratorer (Vivascience, 10 kDa MWCO). Som en vejledning, skønnes det, at ~ 5 ug af en typisk bait-protein (ca. 80 kDa) er tilstrækkelig til at mætte en plade med 96 brønde.
- Bait-proteiner udtrykkes ved høje niveauer kan fortyndet i PBST / 2% BSA til en koncentration tilstrækkelig til at mætte den streptavidin-overtrukne plade. Aktiviteten af agnen bør checkes igen efter fortynding eller koncentration til at sikre, at de mætte alle biotin bindingssteder i streptavidin-coatede plade.
3,2 Prey normalisering
- Kvantificere de relative niveauer, hvor de prey-proteiner udtrykkes ved hjælp af β-lactamaseenzymaktivitet.
- Først en fortyndingsserie af supernatanten indeholdende de prey-proteiner i PBST / 2% BSA buffer. Derefter tilsættes 20 uL af fortyndingerne til 60 gl af en 242 um (0,125 mg / ml) nitrocefin opløsning (Calbiochem).
- Umiddelbart overføres pladen til en mikrotiterplade-læser, der tager en absorbansmålinger ved 485 nm hvert minut i 20 minutter ved stuetemperatur. Repræsentative bytte normaliseringsfaktorer Resultaterne er vist i figur 3B.
- Koncentreres prøver under anvendelse centrifugal koncentratorer eller fortynde dem i PBST / 2% BSA for at nå en tærskelværdi aktivitet ~ 2 nmol min -1 omsætning af nitrocefin. I praksis opnås dette, hvis alle nitrocefin hydrolyseres under ~ 7 minutter.
4. AVEXIS Screening Procedure
- Vaske en streptavidin-overtrukket plade med PBST.
- Tilsæt 100 pi PBST / 2% BSA til hver brønd og inkuberes i 30 minutter for at blokere eventuelle spuriøse proteinbindingssteder i hver brønd.
[Tip: for at fjerne enhver resterende vaskebuffer efter vasketrin, er pladen tappes - energisk - på papirservietter]
- Fjernes blokerende opløsning med en smart svirp af pladen over en vask og tilsæt 100 gl normaliseret biotinyleret monomer lokkemad til de passende brønde og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjerne agn prøver fra pladen ved upturning pladen og smart klippede over en vask, og vask 3 gange i PBST.
- Tilsæt 100 pi af den normaliserede pentamerized byttet konstruere til hver brønd og inkuber ved stuetemperatur i 1 time, vaskes som i trin 4.4 og udføre en afsluttende vask med PBS alene.
- Tilsættes 60 pi 242 uM nitrocefin opløsning (5 mg nitrocefin i 500 pi DMSO, blandes grundigt og derefter yderligere fortynde nitrocefin i 40 ml PBS og passere gennem et 0,22 um filter før tilsætning til pladerne) og inkuber ved stuetemperatur . Positive interaktioner kan observeresmed det blotte øje, idet den gule nitrocefin hydrolyseres til en rød farve. Kvantificere ved aflæsning absorbans ved 485 nm under anvendelse af en pladelæser. En typisk plade og mængdebestemmelse er vist i fig. 4.
[Tip: Positive interaktioner normalt observeres inden for 2 timer ved stuetemperatur, selv plader bør anbringes ved 4 ° C i 16 timer for at sikre alle potentielle interaktioner opdages. Vi har også fundet, at udfældet nitrocefin og ufuldkommenheder i plast i mikrotiterpladen såsom ridser / fingeraftryk lejlighedsvis føre til kulturgenstandsspor falske positiver ved 485 nm på trods nogen åbenlys nitrocefin hydrolyse. Det er derfor tilrådeligt at tage fotografier af pladerne til visuelt at registrere nitrocefin omsætning i brøndene.]
5. Repræsentative resultater
Et eksempel på en repræsentativ AVEXIS screening plade er vist i figur 4. Man bør bemærke hydrolyse (gul til rød) af nitrocefin substratet ipositiv kontrol brøndene (både antistof-medierede bytte indfangning kontrol og også positiv kontrol interaktion) i ti minutter. Nogle interaktioner inden skærmen ses også inden for denne tidsskala, men andre kan tage længere tid (nogle få timer) at dukke op. Typisk et hit-hastighed på omkring 0,4-0,6% (positiv interaktion for hver 150-250 interaktioner, der screenes) er typisk, afhængigt af protein bibliotekerne blev screenet.
Figur 1. Identifikation af receptor-ligand interaktioner der medierer cellulære anerkendelse processer ved hjælp af AVEXIS. Den skematiske viser to vekselvirkende celler (A og B) at udveksle oplysninger gennem interaktioner indgået mellem membran-indlejrede receptor proteiner. AVEXIS er en skalerbar protein-interaktion assay specifikt designet til at identificere hidtil ukendte receptor-ligandpar, som er karakteriseret ved meget svage vekselvirkning styrke. Rekombinant såluble protein biblioteker, der repræsenterer hele ectodomænet af celleoverfladereceptoren repertoire af begge celler indsamles enten som pentamere β-lactamase-mærkede byttedyr (celletype A) eller monomere biotin-mærkede lokkemad (for celletype B). Den pentamerisation af byttedyr forøger den lokale koncentration af de ektodomæner at bevirke en samlet aviditet forstærkning således, at selv meget flygtige interaktioner kan detekteres. Lokkemaden Biblioteket er opstillet på streptavidin-coatede plader og systematisk probet for interaktioner med prey-proteiner. Efter en kort vask, er alle taget byttedyr påvist under anvendelse af β-lactamase-aktivitet forbundet med bytte.
Figur 2. Bait og byttedyr konstruktion design. (A) Rotte CD200 receptorprotein er tilvejebragt som et eksempel på, hvordan hele ektodomæner med celleoverflade-receptorproteiner, bestemmes og primere designet til at gøre både lokkemadog bytte ekspressionskonstruktioner. CDNA-og translaterede proteinsekvens er vist fra den N-terminale signalpeptid til membranomspændende transmembrane region af rotte CD200. En sense-primer er konstrueret til at indbefatte en 5'Notl restriktionsenzymsite og optimal Kozak-sekvens efterfulgt af 25 baser af nøjagtig match sekvens til CD200 cDNA-sekvensen. Antisense primer indeholder en AscI-sted og 25 baser af eksakt match sekvens placeret umiddelbart opstrøms for den valgte ectodomænet trunkering rest. At holde ectodomænet i ramme med rotte Cd4d3 4 tag, skal AscI-sted oversætte som Gly-Ala-Pro. (B) Skematisk gengivelse af lokkemaden og bytte ekspressionskonstruktioner. Hver indeholder receptor ektodomæner flankeret af NotI og ASCI sites og en Cd4d3 4 tag. Agnen indeholder et C-terminalt peptid-sekvens, som specifikt kan monobiotinylated ved cotransfektion med et plasmid, der udtrykker en secerneret BirA-enzymet. De byttedyr følges af pentamerisation sekvensenfra brusk oligomere matrix protein (COMP) og β-lactamase-enzymet.
Figur 3. Normalisering af agn og prey-proteiner. (A) Repræsentative eksempler på agn normalisering. En fortyndingsserie af fire forskellige dialyseret lokkemad supernatanter blev detekteret ved ELISA under anvendelse af et anti-CD4-tag monoklonalt antistof. De fire lokkemad udtrykkes på forskellige niveauer 1> 2> 3> 4. Lokkemad bør normaliseret til en tærskelværdi, der mætter biotin bindingssteder i hver brønd. Højt udtrykte lokkemad kan fortyndes for at bevare protein (f.eks lokkemad 1 kunne fortyndes ~ 1:100) og dårligt udtrykt lokkemad koncentreret. Faldt aflæsninger ved lave fortyndinger undertiden observeres i nogle lokkemad (f.eks lokkemad 2), som kan tilskrives tilstedeværelsen af ukonjugeret D-biotin på grund af ufuldstændig dialyse. (B) på hvilke niveauer bytte proteiner er expressede kvantificeres ved anvendelse af hydrolysehastighed af en β-lactamase-substrat, nitrocefin. I det viste eksempel er de tre byttedyr udtrykkes på forskellige niveauer: bytte 1> 2> 3. Byttedyr bør normaliseret til en aktivitet på ~ 2 nmol min -1, hvilket svarer til fuldstændig hydrolyse af 14,5 nmol nitrocefin i ~ 7 minutter (f.eks bytte 1). De andre byttedyr i dette eksempel skal koncentreres før anvendelse i screening.
Figur 4. Repræsentative AVEXIS screening resultater. (A) et fotografi af en repræsentativ AVEXIS screening plade. Et bytte protein undersøgt mod 41 forskellige lokkemad og et positivt samspil detekteres i godt E2. Kontroller anvendes i screeningen pladerne omfatter: et biotinyleret anti-CD4-antistof til at fange alle prey-proteinet tilsat til brønden (G6), en kontrol interaktion rotte CD200 (lokkemad)-Cd200R (bytte) med Cd200R bytte anvendes ved tærskelværdi fortynding (H3), 1:10 (H4) og 1:100 (H5). Negative kontroller var: Cd4d3 4 agn probet med prey-proteinet, der screenes (H1) og Cd200R byttet (H2). (B) Kvantificering af absorbansværdier for den samme skærm udført in triplo. Datapunkter er gennemsnit ± SD.
Discussion
Når levende celler er observeret in vivo, deres plasmamembraner udviser meget dynamiske adfærd: at udvide og tilbagetrække membran processer, som de kontakt og kommunikere med deres naboer 2. De fysiske interaktioner mellem det membran-indlejrede receptorproteiner, der medierer mange af disse kontakter har udviklet sig til at være yderst svag således at tillade dette meget motile adfærd. Det er blevet anslået, at monomere interaktion styrker svag som 50 uM kunne være tilstrækkelig til at drive spontane interaktioner ved fysiologiske receptor densiteter 9, som gør påvisning hidtil ukendte interaktioner særdeles udfordrende 2,10. Den AVEXIS her beskrevne metode giver en følsom metode til påvisning af forbigående ekstracellulært protein: protein interaktioner, der kan implementeres på en skalerbar måde med en lav falsk positiv rate. Medens andre skalerbare fremgangsmåder er blevet udviklet til påvisning ekstracellulære interaktioner 11-15,En fordel ved AVEXIS er, at de eksperimentelle parametre, såsom lokkemad og bytte aktiviteter er blevet kvantificeret at detektere selv de svageste af interaktioner (t 1/2 ≤ 0,1 s) og samtidig bevare en lav falske positiver 3. Desuden har de strømlinede og robuste procedurer for prøveforberedelse aktiveret denne analyse skal gennemføres på en meget større målestok end andre analyser, og vi har for nylig beskrevet en systematisk samspil skærm i alt over ~~~HEAD=NNS 16.500 potentielle interaktioner 16.
Assayet kan udføres på ethvert protein, som det er muligt at udtrykke et opløseligt rekombinant protein fragment. Dette omfatter derfor proteiner, der indeholder et N-terminalt signalpeptid, såsom type I og GPI-bundne og secernerede proteiner. Vi har for nylig udviklet en suite af vektorer, der nu gør os i stand til at udtrykke type II-proteiner som lokkemad 17. Assayet er generelt ikke egnet til MultiPass membranproteiner, såsom ion transportørs eller pumper, da de er usandsynligt, at være korrekt foldet uden for rammerne af et plasma membran. Vi har anvendt denne til en række forskellige systemer og har med succes udtrykt ekstracellulære proteiner fra zebrafisk 3,16,18, human, mus og P. falciparum for interaktion skærme.
Med hensyn til de nødvendige ressourcer til at oprette en AVEXIS skærmen, har vi fundet, at en væsentlig flaskehals er valg, konstruktion, og fuld sekventering af de ekspressionsplasmider. Dette aspekt af metoden kan tage op til et år for at gøre ~ 100 agn og byttedyr konstruktioner, men med faldende omkostninger genet syntese, vi nu går ind kommercielt outsourcing dette aspekt af projektet. Det pattedyr ekspressionssystem sammen med en stor ryste vævsdyrkningsinkubator (vi bruger en INFORS HT Multitron Cell) giver en enkelt forsker til at udtrykke og normalisere op til ~ 100 agn og prey-proteiner en måned. Når de proteiner produceres og normaliseres, screening for interaktioner er hurtig med op til tolv 96-brønds plader, der hensigtsmæssigt behandles pr. Den eneste skræddersyede udstyr, som vi har udviklet for at lette fremstillingen af et så stort antal proteiner er en komprimeret luft-drevet stempel, som anvendes til at passere op til fem supernatanter gennem et 0,22 um filter i parallel.
Den største klasse af interaktioner, der kan blive savnet når der sammenlignes med interaktioner forventes fra litteraturen (falske negativer) er homophilic interaktioner, selv om nogle af disse interaktioner kan påvises 3. I de tilfælde, hvor forventede interaktioner er ikke opdaget, mener vi, at dette skyldes dannelsen af homophilic interaktioner af de prey-proteiner (en bytte "maskering" effekt), som derefter forhindrer yderligere interaktioner med immobiliserede agn proteiner. Den frekvens, ved hvilken interaktioner detekteres, afhænger af indholdet af proteinet bibliotek, der screenes. Som en vejledning til læseren, en skærm på> 30, 000 interaktioner i zebrafisk immunoglobulin-superfamilien resulterede i 188 positiver - en frekvens på 0,6% 3,16,18. En meget hurtig kontrol af, at der kan udføres for at verificere de positive hits er at bestemme, om interaktion kan påvises i både lokkemad-bytte orienteringer, som er, kan den samme interaktion detekteres uanset om de proteiner er til stede som enten en lokkemad eller et bytte. Når vi har observeret denne frem-og tilbagegående opførsel, er bindingen efterfølgende blevet vist at være specifik ved at påvise direkte mættelig binding af oprensede proteiner under anvendelse af overfladeplasmonresonans. Det skal understreges, at fordi vi øger bindingsaviditet ved kunstig pentamerising bytte proteiner, mener vi ikke, at analysen er egnet til kvantitativt at sammenligne interaktion styrker. For at opnå biofysiske bindende parametre for interaktion vi bruger monomere proteiner og overfladeplasmonresonans. Endelig, når en interaktion er blevet identificeret, high gennemløb art assayet gør det relativt nemt at tilpasse assay til screening for reagenser, såsom antistoffer eller små molekyler, der blokerer interaktionen.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Wellcome Trust tilskud nummer [077108] tildelt GJW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
| Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
| SA-coated microtitre plates | Nalge Nunc international | 734-1284 | |
| OX68 antibody | AbD Serotec | MCA1022R | |
| Dialysis tubing | Pierce, Thermo Scientific | PN68100 | |
| Polymyxin B | Sigma-Aldrich | P4932 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639-5G | |
| Substrate-104 | Sigma-Aldrich | 1040-506 | |
| Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius AG | VS2002 | |
| 0.22 μm filters | Nalge Nunc international | 190-2520 |
References
- Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome research. 18, 622-622 (2008).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, e9-e9 (2002).
- Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G. Improved Prediction of Signal Peptides: SignalP 3.0. Journal of molecular biology. 340, 783-783 (2004).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. Journal of molecular biology. 305, 567-567 (2001).
- Brown, M. H., Barclay, A. N. Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4 for ligand analysis. Protein engineering. 7, 515-515 (1994).
- Wright, G. J., Puklavec, M. J., Willis, A. C. Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes a novel receptor on macrophages implicated in the control of their function. Immunity. 13, 233-23 (2000).
- Dustin, M. L., Golan, D. E., Zhu, D. M. Low affinity interaction of human or rat T cell adhesion molecule CD2 with its ligand aligns adhering membranes to achieve high physiological affinity. The Journal of biological chemistry. 272, (1997).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society transactions. 38, (2010).
- de Wildt, R. M., Tomlinson, I. M., Ong, J. L. Isolation of receptor-ligand pairs by capture of long-lived multivalent interaction complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (2002).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129, 55-55 (2010).
- Urech, D. M., Lichtlen, P., Barberis, A. Cell growth selection system to detect extracellular and transmembrane protein interactions. Biochimica et biophysica acta. 1622, 117-117 (2003).
- Voulgaraki, D., Mitnacht-Kraus, R., Letarte, M. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115, 337-337 (2005).
- Wojtowicz, W. M., Wu, W., Andre, I. A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains. Cell. 130, 1134-1134 (2007).
- Martin, S., Sollner, C., Charoensawan, V. Construction of a Large Extracellular Protein Interaction Network and Its Resolution by Spatiotemporal Expression Profiling. Mol. Cell. Proteomics. 9, 2654-2654 (2010).
- Crosnier, C., Bustamante, L. Y., Bartholdson, S. J., Bei, A. K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum. Nature. 480, 534-537 (2011).
- Sollner, C., Wright, G. J. A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors. Genome biology. 10, R99-R99 (2009).
