AVEXIS er en høy gjennomstrømning protein interaksjon analyse utviklet til systematisk skjermen for romanen ekstracellulære reseptor-ligand par involvert i cellulære anerkjennelse prosesser. Den er spesielt designet for å oppdage forbigående protein interaksjoner som er vanskelig å identifisere ved hjelp av andre med høy gjennomstrømning tilnærminger.
Ekstracellulært protein: protein interaksjoner mellom skilles eller membran-bundet proteiner er avgjørende for både å initiere intercellulær kommunikasjon og sikre samhold innen flercellede organismer. Proteiner spådd å danne ekstracellulære samhandling kodes med cirka en fjerdedel av menneskets gener 1, men til tross for deres betydning og overflod, har de fleste av disse proteinene ingen dokumentert bindende partner. Primært er dette grunnet deres biokjemiske intractability: membran-innebygde proteiner er vanskelig å solubilise i sitt eget eksteriør og inneholder strukturelt viktige posttranslational modifikasjoner. Dessuten er samspillet slektskap mellom reseptor proteiner ofte preget av ekstremt lave samhandling styrker (halveringstider <1 sekund) utelukker deres deteksjon med mange vanlig brukte høy gjennomstrømning metoder 2.
Her beskriver vi en analyse, AVEXIS (grådighet-basert EXtracelluLar Interaction Screen) som overvinner disse tekniske utfordringene som muliggjør påvisning av svært svake protein interaksjoner (t 1/2 ≤ 0,1 sek) med en lav falske positive tre. Analysen er vanligvis implementert i en høy gjennomstrømning format for å muliggjøre systematisk screening av mange tusen interaksjoner i en praktisk microtitre plate format (Fig. 1). Det er avhengig av produksjon av løselige rekombinante protein biblioteker som inneholder ectodomain fragmenter av reseptorer på celleoverflaten eller utskilt proteiner innen hvilke til skjermen for samhandling, og derfor er denne tilnærmingen passer for type I, type II, GPI-koblede reseptorer på celleoverflaten og skilles proteiner, men ikke for MultiPASS membran proteiner som ionekanaler eller transportører.
De rekombinante protein bibliotekene er produsert ved hjelp av en praktisk og høyt nivå pattedyr uttrykk system 4, for å sikre at viktige posttranslational modifikasjoner som glycosylasjon og disulfid obligasjoner legges. Uttrykte rekombinante proteiner utskilles i medium og produsert i to former: en biotinylated agn som kan fanges på en streptavidin-belagt fast fase egnet for screening, og en pentamerised enzym-merket (β-laktamase) byttedyr. Agnet og byttedyr proteiner blir presentert for hverandre i en binær måte å oppdage direkte interaksjoner mellom dem, tilsvarende en konvensjonell ELISA (Fig. 1). Den pentamerisation av proteiner i byttedyr oppnås gjennom en peptidsekvens fra brusk oligomeric matrix protein (COMP) og øker den lokale konsentrasjonen av ectodomains dermed gi betydelige grådighet gevinster å aktivere selv svært forbigående interaksjoner å bli oppdaget. Ved å normalisere virksomhet både agn og byttedyr til forhåndsbestemte nivåer før screening, har vi vist at samhandling har monomere halveringstider på 0,1 sek kan oppdages med lave falske positive priser 3.
Når levende celler er observert in vivo, deres plasmamembranen utvise svært dynamiske atferd: utvide og skuf membranprosesser som de kontakt og kommunisere med sine naboer to. De fysiske interaksjoner mellom membran-embedded reseptor proteiner som formidler mange av disse kontaktene har utviklet seg til å være ekstremt svak, slik som å tillate denne svært bevegelige oppførsel. Det har blitt anslått at monomere samhandling styrker like svak som 50 mikrometer kan være tilstrekkelig til å kjøre spontane interaksjoner på fysiologiske receptor tettheter 9 som gjør oppdage nye interaksjoner ekstremt utfordrende 2,10. Den AVEXIS Metoden er beskrevet her gir en sensitiv metode for å påvise forbigående ekstracellulært protein: protein interaksjoner som kan implementeres i en skalerbar måte med en lav falsk positiv rate. Mens andre skalerbare metoder har blitt utviklet for å oppdage ekstracellulære interaksjoner 11-15,En fordel med AVEXIS er at de eksperimentelle parametere som agn og byttedyr aktiviteter har blitt kvantifisert å oppdage selv den svakeste av interaksjoner (t 1/2 ≤ 0,1 s) og samtidig beholde en lav falske positive tre. I tillegg har strømlinjeformet og robust prøveopparbeidelse prosedyrer aktivert denne analysen skal implementeres på en mye større skala enn andre analyser, og vi har nylig beskrevet en systematisk samhandling skjerm på over ~~~HEAD=NNS 16.500 potensielle interaksjoner 16.
Analysen kan utføres på ethvert protein som det er mulig å uttrykke en løselig rekombinant protein fragment. Dette inkluderer derfor proteiner som inneholder en N-terminal signal peptid som type I, GPI-koblede og utskilt proteiner. Vi har nylig laget en pakke med vektorer som nå gjør oss i stand til å uttrykke type II proteiner som agn 17. Den analysen er vanligvis ikke egnet for MultiPASS membran proteiner som ion transporters eller pumper, siden de er lite sannsynlig å være korrekt brettes utenfor rammen av en plasma membran. Vi har brukt denne til en rekke ulike systemer og har nå uttrykt ekstracellulære proteiner fra 3,16,18 sebrafisk, menneskelige, mus og P. falciparum for interaksjon skjermer.
I forhold til de ressurser som kreves for å sette opp en AVEXIS skjerm, har vi funnet at en betydelig flaskehals er utvalget, konstruksjon, og full sekvensering av uttrykket plasmider. Dette aspektet av metoden kan ta opptil et år å lage ~ 100 agn og byttedyr konstruerer, men med redusere kostnadene for genet syntese, har vi nå favorisere kommersielt outsourcing dette aspektet av prosjektet. Hos pattedyr uttrykket systemet sammen med en stor skjelvende vev kulturinkubatoren (vi bruker en INFORS HT Multitron Cell) muliggjør en enkelt forsker å uttrykke og normalisere opp til ~ 100 agn og byttedyr proteiner en måned. Når proteiner er produsert og normalisert, screening for interaksjoner er rask med opptil tolv 96-brønns plater blir gunstig behandlet per dag. Den eneste skreddersydd utstyr som vi har utviklet for å forenkle produksjonen av et så stort antall proteiner er en komprimert luft-drevet stempel som brukes til å passere opptil fem supernatants gjennom et 0.22μm filter parallelt.
Den største klassen av interaksjoner som kan være savnet i forhold til interaksjoner forventet fra litteraturen (falske negative) er homophilic interaksjoner, selv om noen av disse interaksjonene kan oppdages tre. I de tilfeller der forventede interaksjoner ikke er oppdaget, mener vi at dette skyldes dannelse av homophilic interaksjon ved byttet proteiner (en bytte "maskering" effekt) som igjen hindrer ytterligere samhandling med immobilisert agn proteiner. Frekvensen der samhandling er oppdaget avhenger av innholdet av protein biblioteket bli screenet. Som en veiledning til leseren, en skjerm på> 30Resulterte 000 interaksjoner i sebrafisk immunglobulin superfamily i 188 positiver – en frekvens på 0,6% 3,16,18. En veldig rask sjekk som kan utføres for å kontrollere eventuelle positive treff er å avgjøre om interaksjon kan påvises i både agn-byttedyr orientering, som er, kan den samme interaksjonen bli oppdaget uavhengig av om proteiner er til stede enten som agn eller et bytte. Når vi har observert dette gjensidighetsavtaler atferd, har den bindende senere vist seg å være spesifikk ved å demonstrere direkte mettbar binding av renset proteiner med overflaten plasmon resonans. Det bør understrekes at fordi vi øke bindingen grådighet ved å kunstig pentamerising byttet proteinene vi ikke anser at analysen egnet for kvantitativt sammenlikne interaksjon styrker. For å oppnå biofysiske bindende parametere for interaksjon vi bruker monomere proteiner og overflate plasmon resonans. Til slutt, når en interaksjon har blitt identifisert, hiGH gjennomstrømning natur analysen gjør det relativt enkelt å tilpasse analysen til skjermen for reagenser som antistoffer eller små molekyler som blokkerer interaksjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Wellcome Trust tilskuddet nummer [077108] tildelt GJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |