AVEXIS هو بروتين إنتاجية عالية مقايسة التفاعل المتقدمة إلى الشاشة بشكل منتظم لرواية أزواج مستقبلات يجند خارج الخلية المشاركة في عمليات التعرف على الخليوي. وهي مصممة خصيصا للكشف عن بروتين تفاعلات عابرة يصعب تحديد استخدام غيرها من النهج إنتاجية عالية.
بروتين خارج الخلية: التفاعلات بين البروتينات أو تفرز بروتينات غشاء المربوطة حاسمة بالنسبة لكل من التماسك بدء الاتصالات بين الخلايا، وضمان في الكائنات متعددة الخلايا. وتوقع لتشكيل البروتينات يتم ترميز التفاعلات خارج الخلية بمقدار الربع تقريبا من الجينات البشرية 1، ولكن على الرغم من أهميتها وفرة، وغالبية هذه البروتينات وقد وثقت لا شريك ملزم. في المقام الأول، وهذا يرجع إلى استعصاء على البيوكيميائية: بروتينات غشاء جزءا لا يتجزأ من الصعب solubilise في التشكل وطنهم وتحتوي على تعديلات posttranslational الهيكلية الهامة. أيضا، وتتميز في كثير من الأحيان الانتماءات تفاعل بين البروتينات المستقبلة من قبل القوة تفاعل منخفضة للغاية (نصف حياة <1 2) النافية الكشف عنها مع العديد من الشائع استخدام أساليب إنتاجية عالية 2.
هنا، نحن تصف فحص، AVEXIS (الطمع القائم على EXtracelluلار التفاعل الشاشة) أن يتغلب على هذه التحديات التقنية التي تمكن من الكشف عن تفاعلات البروتين ضعيف جدا (ر 1/2 ≤ 0.1 ثانية) مع انخفاض معدل إيجابية كاذبة 3. وينفذ عادة الفحص في شكل إنتاجية عالية لتمكين فحص المنتظم لعدة آلاف من التفاعلات في شكل لوحة microtitre مناسب (الشكل 1). لأنه يعتمد على إنتاج بروتين قابل للذوبان المكتبات المؤتلف التي تحتوي على شظايا ectodomain من مستقبلات سطح الخلية أو البروتينات يفرز من خلاله للكشف عن التفاعلات، وبالتالي، فإن هذا النهج هو مناسبة لنوع أنا، من النوع الثاني، GPI المرتبطة مستقبلات سطح الخلية وتفرز البروتينات ولكن ليس للبروتينات غشاء المتعددة الدخول مثل القنوات الأيونية أو النقل.
ويتم إنتاج بروتين المؤتلف المكتبات باستخدام مريحة وعلى مستوى رفيع نظام التعبير الثدييات 4، لضمان أن تعديلات هامة posttranslational مثل glycosylaتضاف نشوئها وثاني كبريتيد السندات. تفرز البروتينات المؤتلف وأعرب في المتوسط والتي تنتج في شكلين: الطعم المعقدة البيروكسيديز التي يمكن الحصول عليها في مرحلة streptavidin المغلفة صلبة مناسبة للفحص، وpentamerised انزيم الموسومة فريسة (β-اكتاماز). يتم تقديم الطعم والبروتينات فريسة لبعضها البعض على نحو ثنائي للكشف عن التفاعلات المباشرة بينهما، على غرار ELISA التقليدية (الشكل 1). يتحقق pentamerisation من البروتينات في الفريسة من خلال سلسلة ببتيد من المصفوفة بروتين غضروف oligomeric (شركات) ويزيد من تركيز المحلية لectodomains مما يوفر مكاسب كبيرة لتمكين الطمع إلى أن يتم الكشف عن التفاعلات حتى عابر جدا. من قبل تطبيع أنشطة الطعم على حد سواء وفريسة لمستويات محددة سلفا قبل الفرز، وأظهرنا أنه يمكن الكشف عن وجود تفاعلات أحادى نصف حياة 0.1 ثانية مع انخفاض معدلات إيجابية كاذبة 3.
عندما لاحظ الخلايا الحية في الجسم الحي، والأغشية البلازما من معرض السلوكيات ديناميكية للغاية: مد وعمليات غشاء التراجع لأنها الاتصال والتواصل مع 2 جيرانهم. وقد تطورت التفاعلات الجسدية بين بروتينات مستقبلات غشاء جزءا لا يتجزأ من الذي توسط في العديد من هذه الاتصالات ان يكون ضعيفا جدا بحيث تسمح لهذا السلوك متحركة جدا. وتشير التقديرات إلى أن قوة التفاعل أحادى على أنه ضعيف إلى 50 ميكرومتر يمكن أن يكون كافيا لدفع التفاعل العفوي بكثافة مستقبلات الفسيولوجية (9) الذي يجعل الكشف عن التفاعلات رواية صعبة للغاية 2،10. طريقة AVEXIS الموصوفة هنا يوفر طريقة حساسة للكشف عن البروتين خارج الخلية عابر: تفاعلات البروتين التي يمكن تنفيذها بطريقة متدرجة مع انخفاض معدل إيجابية كاذبة. في حين وضعت أساليب للتحجيم أخرى للكشف عن التفاعلات خارج الخلية 11-15،ميزة واحدة من AVEXIS هي التي تم كميا المعلمات التجريبية مثل الطعم والأنشطة فريسة للكشف عن حتى أضعف من التفاعلات (ر 1/2 ≤ 0.1 ق) مع الحفاظ على انخفاض معدل إيجابية كاذبة 3. وبالإضافة إلى ذلك، مكنت إعداد نموذج مبسط ومتين إجراءات هذا الفحص إلى أن تنفذ على نطاق أوسع بكثير من فحوصات أخرى والتي وصفناها في الآونة الأخيرة على شاشة تفاعل منهجي تقدر بأكثر من التفاعلات المحتملة 16500 ~ 16.
لا يمكن أن يؤديها للفحص في أي من البروتين الذي كان من الممكن للتعبير عن ذوبان قطعة بروتين المؤتلف. وهذا يشمل ذلك البروتينات التي تحتوي على الببتيد إشارة N-محطة مثل النوع الأول، GPI مرتبطة وتفرز بروتينات. لقد قمنا بتصميم مؤخرا مجموعة من النواقل التي تمكن الآن لنا للتعبير عن نوع من البروتينات الثاني والطعم 17. الفحص ليست عادة مناسبة للبروتينات غشاء المتعددة الدخول مثل نقل أيونق أو مضخات لأنها من غير المرجح أن تكون مطوية بشكل صحيح خارج سياق غشاء البلازما. وقد طبقنا هذا على مجموعة متنوعة من نظم مختلفة وأعربوا عن بنجاح البروتينات خارج الخلية من الزرد 3،16،18، والبشرية، والفأرة P. المنجلية لشاشات التفاعل.
من حيث الموارد اللازمة لانشاء شاشة AVEXIS، وجدنا ان عنق الزجاجة أهمية هو اختيار، والبناء، والتسلسل الكامل للالبلازميدات التعبير. ويمكن في هذا الجانب من أسلوب يستغرق فترة تصل الى عام لجعل ~ 100 الطعم والبنى فريسة، ولكن، مع انخفاض تكاليف التركيب الجيني، نؤيد الآن تجاريا الاستعانة بمصادر خارجية في هذا الجانب من المشروع. نظام التعبير الثدييات جنبا إلى جنب مع كبير يهز الأنسجة حاضنة الثقافة (ونحن استخدام خلية INFORS Multitron HT) تمكن الباحث وحيد للتعبير عن وتطبيع ما يصل الى 100 ~ الطعم والبروتينات فريسة في الشهر. مرة واحدة ويتم إنتاج البروتينات وتطبيع، قcreening للتفاعل سريع مع ما يصل إلى 12 لوحات 96-جيدا يتم معالجتها بشكل ملائم في اليوم الواحد. المعدات مفصل إلا أننا قد وضعت لتسهيل انتاج هذا العدد الكبير من البروتينات هو هواء مضغوط يحركها المكبس الذي يستخدم لتمرير ما يصل الى خمسة supernatants من خلال مرشح 0.22μm بشكل متواز.
الطبقة الرئيسية من التفاعلات التي قد غاب بالمقارنة مع التفاعلات المتوقعة من الأدب (كاذبة سلبيات) هي التفاعلات مقتصر على المطابق، على الرغم من أن يمكن الكشف عن بعض من هذه التفاعلات 3. في الحالات التي لم يتم الكشف عن التفاعلات المتوقعة، نعتقد أن هذا يرجع إلى تشكيل التفاعلات مقتصر على المطابق من البروتينات فريسة (أ فريسة "اخفاء" التأثير) الذي يحول دون مزيد من التفاعل ثم مع البروتينات الطعم يجمد. التردد الذي يتم الكشف عن التفاعلات يعتمد على محتوى مكتبة بروتين يجري فرزهم. كدليل للقارئ، وشاشة من> 30، نتج 000 التفاعلات داخل الفصيلة المناعي الزرد في 188 ايجابيات – تردد 0.6٪ 3،16،18. شيك سريع جدا التي يمكن القيام بها للتحقق من أي إصابات إيجابية تتمثل في تحديد ما إذا كان يمكن الكشف عن تفاعل التوجهات في الطعم والفريسة على حد سواء وهذا هو، ويمكن الكشف عن التفاعل نفسه بغض النظر عن ما إذا كانت ملزمة البروتينات موجودة إما الطعم أو فريسة. كلما لاحظنا هذا السلوك تبادل، وبعد ذلك تم الربط أظهرت أن تكون محددة من خلال إظهار ملزم تشبع مباشرة لتنقية البروتينات باستخدام سطح صدى مأكل. وينبغي التأكيد على أن زيادة الطمع، لأننا ملزم من قبل pentamerising مصطنع البروتينات فريسة، ونحن لا نعتبر فحص مناسبة للمقارنة كميا قوة التفاعل. للحصول على المعلمات ملزم البيوفيزيائية من التفاعلات نستخدم البروتينات أحادى وسطح صدى مأكل. أخيرا، مرة واحدة وقد تم التعرف على التفاعل، ومرحباغ طبيعة الإنتاجية للفحص يجعل من السهل نسبيا على التكيف مع الفحص للكشف عن المواد الكاشفة مثل الأجسام المضادة أو الجزيئات الصغيرة التي تعمل على منع التفاعل.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل عدد يلكوم ترست منحة [077108] منحت لGJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |