AVEXIS er et højt gennemløb protein-interaktion assay udviklet til systematisk screening for hidtil ukendte ekstracellulære receptor-ligand-par involveret i cellulære genkendelse processer. Det er specielt designet til at detektere transiente proteininteraktioner, der er vanskelige at identificere ved hjælp af andre højt gennemløb fremgangsmåder.
Ekstracellulært protein: protein-interaktioner mellem secerneres eller membran-bundne proteiner er kritiske for begge initiering intercellulær kommunikation og sikre sammenhæng inden multicellulære organismer. Proteiner forventes at danne ekstracellulære interaktioner kodet af cirka en fjerdedel af menneskelige gener 1, men på trods af deres betydning og overflod, har de fleste af disse proteiner ingen dokumenteret bindende partner. Primært, skyldes deres biokemiske intractability: membran-indlejrede proteiner er vanskelige at solubilisere i deres native konformation, og som indeholder strukturelt vigtige posttranslationelle modifikationer. Desuden er samspillet tilhørsforhold mellem receptorproteinerne ofte kendetegnet ved ekstremt lave interaktion styrker (halveringstider <1 sekund) til hinder for deres opdagelse med mange almindeligt anvendte high throughput metoder 2.
Her beskriver vi en analyse, AVEXIS (Avidity-baserede EXtracelluLAR Interaktion skærm), der overvinder disse tekniske udfordringer muliggør påvisning af meget svage proteininteraktioner (t 1/2 ≤ 0,1 sek) med en lav falske positiver 3. Assayet gennemføres normalt i et højt gennemløb format at muliggøre systematisk screening af tusinder af interaktioner i en bekvem mikrotiterplade format (fig. 1). Den er afhængig af produktionen af opløselige rekombinante protein biblioteker, der indeholder ectodomænet fragmenter af celleoverfladereceptorer eller secernerede proteiner, til at screene for interaktioner og derfor er denne fremgangsmåde er egnet til type I, type II, GPI-linked celleoverfladereceptorer og secerneret proteiner, men ikke for MultiPass membranproteiner, såsom ionkanaler eller transportører.
Det rekombinante protein biblioteker fremstilles ved anvendelse af en bekvem og højt niveau mammalia-ekspressionssystem 4, for at sikre, at vigtige posttranslationelle modifikationer, såsom glycosylation og disulfid obligationer er tilføjet. Udtrykte rekombinante proteiner udskilles i mediet og fremstillet i to former: en biotinyleret lokkemad, som kan indfanges på en streptavidin-overtrukket fast fase der er egnet til screening, og en pentamerised enzym-mærkede (β-lactamase) bytte. Lokkemaden og prey-proteiner præsenteres til hinanden i en binær måde at detektere direkte interaktioner mellem dem, der ligner en konventionel ELISA (fig. 1). Den pentamerisation af proteinerne i bytte opnås ved en peptidsekvens fra brusk oligomere matrix protein (COMP) og øger den lokale koncentration af de ektodomæner hvorved der opnås betydelige aviditet gevinster til at selv meget kortvarige interaktioner, der skal detekteres. Ved at normalisere aktiviteter både agn og bytte til forudbestemte niveauer forud for screening, har vi vist, at interaktioner med monomere halveringstider på 0,1 sek kan påvises med lave falske positive satser 3.
Når levende celler er observeret in vivo, deres plasmamembraner udviser meget dynamiske adfærd: at udvide og tilbagetrække membran processer, som de kontakt og kommunikere med deres naboer 2. De fysiske interaktioner mellem det membran-indlejrede receptorproteiner, der medierer mange af disse kontakter har udviklet sig til at være yderst svag således at tillade dette meget motile adfærd. Det er blevet anslået, at monomere interaktion styrker svag som 50 uM kunne være tilstrækkelig til at drive spontane interaktioner ved fysiologiske receptor densiteter 9, som gør påvisning hidtil ukendte interaktioner særdeles udfordrende 2,10. Den AVEXIS her beskrevne metode giver en følsom metode til påvisning af forbigående ekstracellulært protein: protein interaktioner, der kan implementeres på en skalerbar måde med en lav falsk positiv rate. Medens andre skalerbare fremgangsmåder er blevet udviklet til påvisning ekstracellulære interaktioner 11-15,En fordel ved AVEXIS er, at de eksperimentelle parametre, såsom lokkemad og bytte aktiviteter er blevet kvantificeret at detektere selv de svageste af interaktioner (t 1/2 ≤ 0,1 s) og samtidig bevare en lav falske positiver 3. Desuden har de strømlinede og robuste procedurer for prøveforberedelse aktiveret denne analyse skal gennemføres på en meget større målestok end andre analyser, og vi har for nylig beskrevet en systematisk samspil skærm i alt over ~~~HEAD=NNS 16.500 potentielle interaktioner 16.
Assayet kan udføres på ethvert protein, som det er muligt at udtrykke et opløseligt rekombinant protein fragment. Dette omfatter derfor proteiner, der indeholder et N-terminalt signalpeptid, såsom type I og GPI-bundne og secernerede proteiner. Vi har for nylig udviklet en suite af vektorer, der nu gør os i stand til at udtrykke type II-proteiner som lokkemad 17. Assayet er generelt ikke egnet til MultiPass membranproteiner, såsom ion transportørs eller pumper, da de er usandsynligt, at være korrekt foldet uden for rammerne af et plasma membran. Vi har anvendt denne til en række forskellige systemer og har med succes udtrykt ekstracellulære proteiner fra zebrafisk 3,16,18, human, mus og P. falciparum for interaktion skærme.
Med hensyn til de nødvendige ressourcer til at oprette en AVEXIS skærmen, har vi fundet, at en væsentlig flaskehals er valg, konstruktion, og fuld sekventering af de ekspressionsplasmider. Dette aspekt af metoden kan tage op til et år for at gøre ~ 100 agn og byttedyr konstruktioner, men med faldende omkostninger genet syntese, vi nu går ind kommercielt outsourcing dette aspekt af projektet. Det pattedyr ekspressionssystem sammen med en stor ryste vævsdyrkningsinkubator (vi bruger en INFORS HT Multitron Cell) giver en enkelt forsker til at udtrykke og normalisere op til ~ 100 agn og prey-proteiner en måned. Når de proteiner produceres og normaliseres, screening for interaktioner er hurtig med op til tolv 96-brønds plader, der hensigtsmæssigt behandles pr. Den eneste skræddersyede udstyr, som vi har udviklet for at lette fremstillingen af et så stort antal proteiner er en komprimeret luft-drevet stempel, som anvendes til at passere op til fem supernatanter gennem et 0,22 um filter i parallel.
Den største klasse af interaktioner, der kan blive savnet når der sammenlignes med interaktioner forventes fra litteraturen (falske negativer) er homophilic interaktioner, selv om nogle af disse interaktioner kan påvises 3. I de tilfælde, hvor forventede interaktioner er ikke opdaget, mener vi, at dette skyldes dannelsen af homophilic interaktioner af de prey-proteiner (en bytte "maskering" effekt), som derefter forhindrer yderligere interaktioner med immobiliserede agn proteiner. Den frekvens, ved hvilken interaktioner detekteres, afhænger af indholdet af proteinet bibliotek, der screenes. Som en vejledning til læseren, en skærm på> 30, 000 interaktioner i zebrafisk immunoglobulin-superfamilien resulterede i 188 positiver – en frekvens på 0,6% 3,16,18. En meget hurtig kontrol af, at der kan udføres for at verificere de positive hits er at bestemme, om interaktion kan påvises i både lokkemad-bytte orienteringer, som er, kan den samme interaktion detekteres uanset om de proteiner er til stede som enten en lokkemad eller et bytte. Når vi har observeret denne frem-og tilbagegående opførsel, er bindingen efterfølgende blevet vist at være specifik ved at påvise direkte mættelig binding af oprensede proteiner under anvendelse af overfladeplasmonresonans. Det skal understreges, at fordi vi øger bindingsaviditet ved kunstig pentamerising bytte proteiner, mener vi ikke, at analysen er egnet til kvantitativt at sammenligne interaktion styrker. For at opnå biofysiske bindende parametre for interaktion vi bruger monomere proteiner og overfladeplasmonresonans. Endelig, når en interaktion er blevet identificeret, high gennemløb art assayet gør det relativt nemt at tilpasse assay til screening for reagenser, såsom antistoffer eller små molekyler, der blokerer interaktionen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Wellcome Trust tilskud nummer [077108] tildelt GJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |