AVEXIS een high throughput assay ontwikkeld eiwit interactie systematisch scherm nieuwe extracellulaire receptor-ligand paar betrokken bij cellulaire opname processen. Het is specifiek ontworpen om voorbijgaande eiwit interacties die zijn moeilijk te identificeren met behulp van andere high throughput benaderingen op te sporen.
Extracellulair eiwit: eiwit interacties tussen uitgescheiden of membraan-tethered-eiwitten zijn van cruciaal belang voor zowel het initiëren intercellulaire communicatie en het waarborgen van de samenhang binnen meercellige organismen. Eiwitten voorspeld te vormen extracellulaire interacties worden gecodeerd met ongeveer een kwart van de menselijke genen 1, maar ondanks hun belang en de overvloed, de meeste van deze eiwitten zijn er geen gedocumenteerde bindende partner. De eerste plaats is dit te wijten aan hun biochemische eigenzinnigheid: membraan-ingebed eiwitten zijn moeilijk te oplosbaar in hun natieve conformatie en bevatten structureel belangrijke posttranslationele modificaties. Ook de interactie affiniteiten tussen receptor-eiwitten vaak gekenmerkt door een uiterst lage interactie sterke punten (halveringstijd <1 seconde) zich verzetten tegen hun detectie met een groot aantal veelgebruikte high throughput methoden 2.
We beschrijven hier een test, AVEXIS (aviditeit-based EXtracelluLAR Interactie Scherm) dat deze technische uitdagingen waarmee de detectie van zeer zwakke eiwit interacties (t 1/2 ≤ 0,1 sec) met een laag vals-positieve tarief 3 overwint. De test wordt gewoonlijk uitgevoerd in een high throughput formaat systematische screening van duizenden interacties in een geschikte vorm microtiterplaat (Fig. 1) in te schakelen. Het berust op de productie van oplosbare recombinante eiwit bibliotheken die de ectodomein fragmenten van celoppervlaktereceptoren of uitgescheiden eiwitten waarin het screenen van interacties bevatten, daarom is deze benadering voor type I, type II, GPI gekoppelde celoppervlakreceptoren en uitgescheiden eiwitten maar niet multipass membraan eiwitten zoals ionkanalen of transporteurs.
Het recombinant eiwit bibliotheken worden geproduceerd met een handige en hoogwaardige zoogdierexpressiesysteem 4, die belangrijke posttranslationele modificaties zoals glycosyla zorgenTIE en disulfidebindingen worden toegevoegd. Uitgedrukt recombinante eiwitten worden uitgescheiden in het medium en geproduceerd in twee vormen: een gebiotinyleerde aas die kan worden vastgelegd op een streptavidine-gecoate vaste fase die geschikt zijn voor screening, en een pentamerised enzym-gelabeld (β-lactamase) prooi. De lokaas en prooi eiwitten worden aan elkaar in een binair wijze directe interactie tussen, vergelijkbaar met een conventionele ELISA (Fig. 1) detecteren. De pentamerisation van de eiwitten in de prooi wordt bereikt door een peptide sequentie van het kraakbeen oligomere matrix eiwit (COMP) en verhoogt de lokale concentratie van de ectodomains wat significante aviditeit winsten in staat te stellen zelfs zeer voorbijgaande interacties te detecteren. Door het normaliseren van de activiteiten van zowel het aas en ten prooi aan vooraf bepaalde niveaus voorafgaand aan de screening hebben we laten zien dat de interacties met monomere halfwaardetijden van 0,1 sec kan worden gedetecteerd met een laag percentage valse positieven 3.
Bij levende cellen worden waargenomen in vivo, hun plasma membranen vertonen zeer dynamische gedrag: in-en uitrollen membraanprocessen als ze contact op te nemen en communiceren met hun buren 2. De fysieke wisselwerking tussen het membraan-ingebed receptor-eiwitten die veel van deze contacten bemiddelen hebben zich ontwikkeld tot een uiterst zwak om dit zeer beweeglijke gedrag mogelijk te maken. Er wordt geschat dat de monomere interactie sterke punten zo zwak als 50 pM kan volstaan om de spontane interacties op fysiologische receptor dichtheden 9, dat maakt het opsporen van nieuwe interacties extreem uitdagend 2,10 rijden. De AVEXIS hier beschreven methode is een gevoelige methode voor het detecteren van transiënte extracellulair eiwit: eiwit interacties die kunnen op een schaalbare manier worden uitgevoerd met een lage valse meldingen. Terwijl andere schaalbaar methoden zijn ontwikkeld voor het detecteren extracellulaire interacties 11-15een voordeel van AVEXIS is dat de experimentele parameters, zoals het aas en prooi activiteiten zijn gekwantificeerd om zelfs detecteren van de zwakste van de interacties (t 1/2 ≤ 0,1 s) met behoud van een lage valse meldingen 3. Daarnaast zijn de gestroomlijnde en robuuste monstervoorbehandelingsprocedures staat deze test uit te voeren op een veel grotere schaal dan andere testen en we hebben onlangs beschreven op een systematische interactie scherm in totaal meer dan ~ 16.500 mogelijke interacties 16.
De test kan worden uitgevoerd op een eiwit dat het mogelijk is geven een oplosbare recombinante eiwit fragment. Dit omvat ook eiwitten die een N-terminale signaalpeptide als type I, GPI gekoppeld en uitgescheiden eiwitten bevatten. We hebben onlangs ontwierpen een reeks van vectoren die nu ons in staat stellen type II eiwitten tot expressie als aas 17. De test het algemeen niet geschikt voor multipass membraan eiwitten zoals ion transporters of pompen, omdat zij waarschijnlijk correct gevouwen buiten het kader van de plasmamembraan. We hebben toegepast om een verscheidenheid van verschillende systemen en succes uitgedrukt extracellulaire eiwitten zebravis 3,16,18, mens, muis en P. falciparum voor interactie schermen.
In termen van de middelen die nodig zijn om een AVEXIS scherm, hebben we ontdekt dat een belangrijk knelpunt is de selectie, bouw, en de volledige sequentie van het expressieplasmiden. Dit aspect van de methode kan tot een jaar ~ 100 lokaas en prooi constructies te maken, maar met de dalende kosten van gen-synthese, hebben we nu in de handel te bevorderen besteden dit aspect van het project. Het zoogdierexpressiesysteem samen met een groot schudden weefselkweek incubator (gebruiken we een INFORS HT Multitron Cell) kan een enkele onderzoeker uit te drukken en te normaliseren tot ~ 100 lokaas en prooi eiwitten per maand. Zodra de eiwitten worden geproduceerd en genormaliseerd, screening interacties is snel met tot twaalf 96-wells platen worden vervolgens verwerkt per dag. De enige maat apparatuur die wij hebben ontworpen om de productie van dergelijke grote aantal eiwitten vergemakkelijken is perslucht aangedreven zuiger die gebruikt wordt om tot voorbij vijf supernatanten door een filter 0.22μm parallel.
De belangrijkste klasse van interacties die kunnen gemist worden in vergelijking met de interacties verwacht van de literatuur (fout-negatieven) zijn homophilic interacties, hoewel sommige van deze interacties kunnen worden gedetecteerd 3. In de gevallen waarin te verwachten interacties niet worden gedetecteerd, zijn wij van mening dat dit te wijten is aan de vorming van homophilic interacties door de prooi eiwitten (een prooi "maskeren"-effect), die vervolgens voorkomt verdere interacties met geïmmobiliseerde aas eiwitten. De frequentie waarmee interacties gedetecteerd afhankelijk van de inhoud van het eiwit bibliotheek worden gescreend. Als richtlijn voor de lezer, een scherm van> 30, 000 interacties binnen de zebravis immunoglobuline superfamilie resulteerde in 188 meldingen – een frequentie van 0,6% 3,16,18. Een snelle controle kan worden uitgevoerd om positieve resultaten verifiëren om te bepalen of de interactie kan worden gedetecteerd in zowel lokaas-prooi oriëntaties, die kan dezelfde interactie onafhankelijk worden gedetecteerd of de eiwitten aanwezig als ofwel een lokaas of een prooi. Wanneer we deze heen en weer gaande gedrag waargenomen, is de binding vervolgens aangetoond om specifiek te zijn door aan te tonen direct verzadigbare binding van gezuiverde eiwitten met oppervlakte-plasmonresonantie. Benadrukt moet worden dat, omdat we binding aviditeit te verhogen door kunstmatig pentamerising de prooi eiwitten, we niet de test geschikt is voor kwantitatief vergelijken van interactie sterke punten te overwegen. Om biofysische binding parameters van de interacties die we gebruiken monomere proteïnen en Surface Plasmon Resonance te verkrijgen. Ten slotte, als een interactie is geïdentificeerd, de high doorvoer aard van de assay maakt het relatief eenvoudig aan te passen aan de test scherm reagentia zoals antilichamen of kleine moleculen die de interactie blokkeren.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Wellcome Trust subsidie nummer [077108] toegekend aan GJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |