AVEXIS ist ein Hochdurchsatz-Protein-Interaktion Assay entwickelt, um systematisch Bildschirm für neue extrazelluläre Rezeptor-Ligand-Paare in der Zellerkennung Prozessen beteiligt sind. Es ist speziell entwickelt, um transienten Protein-Interaktionen, die schwer zu identifizieren, die mit anderen hohen Durchsatz Ansätze sind zu erkennen.
Extrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen sezernierten oder Membran-gebundene Proteine sind entscheidend für die Einleitung sowohl Kommunikation und die Kohäsion in vielzelligen Organismen. Vorhergesagten Proteine zu bilden extrazelluläre Interaktionen um rund ein Viertel der menschlichen Gene 1 kodiert sind, aber trotz ihrer Bedeutung und Fülle, die Mehrzahl dieser Proteine haben keine Bindungspartner dokumentiert. In erster Linie ist dies auf Grund ihrer biochemischen Widerspenstigkeit: Membran-Proteine eingebettet sind schwer in nativer Konformation solubilisieren und enthalten strukturell wichtige posttranslationale Modifikationen. Auch sind die Interaktion Affinitäten zwischen Rezeptor-Proteine oft durch äußerst geringe Stärke der Wechselwirkung (Halbwertszeiten <1 Sekunde) entgegensteht, ihr Nachweis mit vielen häufig verwendeten Hochdurchsatzmethoden 2 gekennzeichnet.
Hier beschreiben wir einen Test, AVEXIS (Gier-basierte extrazellulärenlar Interaction Screen), die diese technischen Herausforderungen ermöglicht die Detektion von sehr schwachen Protein-Wechselwirkungen (t 1/2 ≤ 0,1 sec) mit einer niedrigen Rate an falsch positiven 3 umgeht. Der Assay wird in der Regel in einem Format mit hohem Durchsatz durchgeführt, um die systematische Screening von vielen Tausenden von Wechselwirkungen in einem geeigneten Mikrotiterplatten-Format (1) zu ermöglichen. Es stützt sich auf die Produktion von löslichem rekombinanten Protein-Bibliotheken, die die Ektodomäne Fragmente von Zelloberflächenrezeptoren oder sekretierte Proteine in dem für Wechselwirkungen zu screenen, um enthalten, daher ist dieser Ansatz für Typ I, Typ II, GPI-gebundene Rezeptoren auf der Zelloberfläche und sezernierte Proteine, nicht aber für Multipass-Membranproteine wie Ionenkanäle oder transporter.
Die rekombinanten Protein-Bibliotheken werden unter Verwendung eines bequemen und High-Level-Säuger-Expressionssystem 4, an, dass wichtige posttranslationale Modifikationen wie Glycosylierung gewährleistention und Disulfidbindungen hinzugefügt werden. Ein biotinylierter Köder, an einer mit Streptavidin beschichtete feste Phase für das Screening geeignet erfasst werden kann, und einer enzymmarkierten pentamerisierten (β-Lactamase) Beute: exprimierten rekombinanten Proteine in das Medium und produziert in zwei Formen sezerniert. Die Bait und Prey-Proteine sind miteinander in einer binären Weise direkten Wechselwirkungen zwischen ihnen, ähnlich einem herkömmlichen ELISA (Abb. 1) zu erfassen dargestellt. Die pentamerisation der Proteine in der Beute durch eine Peptidsequenz aus dem Knorpel oligomere Matrix-Protein (COMP) erreicht und erhöht die lokale Konzentration der Ektodomänen damit eine signifikante Avidität Gewinne zu ermöglichen, auch sehr kurzlebige Wechselwirkungen zu detektieren. Durch die Normierung der Aktivitäten sowohl der Köder und Beute zu vorgegebenen Niveaus vor dem Screening, haben wir gezeigt, dass Wechselwirkungen mit monomeren Halbwertszeiten von 0,1 s mit niedrige False-Positive Raten 3 erkannt werden können.
Bei lebenden Zellen in vivo beobachtet werden, zeigen ihre Plasmamembranen hochdynamische Verhalten: Ein-und Ausfahren Membranverfahren, wie sie und wenden sich mit ihren Nachbarn 2. Die physikalische Wechselwirkungen zwischen der Membran eingelagerten Rezeptorproteine, die viele dieser Kontakte zu vermitteln haben sich als äußerst schwach, so dass diese sehr beweglichen Verhalten zu ermöglichen. Es wurde geschätzt, dass monomere Stärke der Wechselwirkung so schwach wie 50 uM könnte ausreichend sein, um spontane Interaktionen bei physiologischen Rezeptor Dichten 9, die Erkennung neuartiger Interaktionen extrem herausfordernd 2,10 macht zu fahren. Die AVEXIS hier beschriebene Methode stellt eine empfindliche Methode zum Nachweis von transienten extrazellulären Protein-Protein-Interaktionen, die in eine skalierbare Art und Weise mit einer niedrigen Rate an falsch positiven umgesetzt werden können. Während andere skalierbare Verfahren wurden entwickelt, um auf extrazelluläre Wechselwirkungen 11-15,Ein Vorteil der AVEXIS ist, dass die experimentellen Parameter wie die Köder und Beute Aktivitäten wurden quantifiziert, um selbst die schwächste von Interaktionen (t 1/2 ≤ 0,1 s) unter Beibehaltung eines niedrige False-Positive-Rate 3. Darüber hinaus haben sich die schlanke und robuste Verfahren zur Probenaufbereitung, diesen Test aktivieren, damit Sie auf einem viel größeren Maßstab als andere Assays durchgeführt werden, und wir haben vor kurzem eine systematische Interaktion Bildschirm im Gesamtwert von über 16.500 potentielle Wechselwirkungen ~ 16 beschrieben.
Der Assay kann auf jedem Protein, für das es möglich ist, ein lösliches rekombinantes Protein-Fragment exprimieren durchgeführt werden. Umfasst werden also Proteine, die eine N-terminale Signalpeptid wie Typ I, GPI-linked und sekretierte Proteine enthalten. Wir haben kürzlich eine Reihe von Vektoren, die uns nun ermöglichen, Typ-II-Proteine als Köder 17 Express konzipiert. Der Test ist im Allgemeinen nicht geeignet für Multipass Membranproteine wie Ionen-Transporters oder Pumpen, da sie wahrscheinlich nicht vollständig außerhalb des Kontextes eines Plasmamembran gefaltet werden. Wir führen dies auf eine Vielzahl von unterschiedlichen Systemen angewandt und haben erfolgreich exprimiert extrazelluläre Proteine aus Zebrafisch 3,16,18, von Mensch, Maus und S. falciparum für die Interaktion Bildschirme.
Im Hinblick auf die erforderlichen Ressourcen zur Einrichtung eines AVEXIS Bildschirm haben wir festgestellt, dass ein erheblicher Engpass die Auswahl, den Bau und die vollständige Sequenzierung der Expressionsplasmide ist. Dieser Aspekt des Verfahrens kann bis zu einem Jahr auf ~ 100 Bait und Prey-Konstrukte machen, jedoch mit der sinkenden Kosten für Gensynthese haben wir jetzt im Handel begünstigen Auslagerung dieser Aspekt des Projekts. Die Säuger-Expression System zusammen mit einer großen Schütteln Gewebekultur-Inkubator (wir verwenden eine INFORS HT Multitron Cell) ermöglicht einem einzelnen Forscher zu äußern und zu normalisieren bis ~ 100 Köder und Beute-Proteine im Monat. Sobald die Proteine produziert werden und normiert, screening für Wechselwirkungen ist schnell mit bis zu zwölf 96-well Platten in bequemer pro Tag verarbeitet. Die einzige maßgeschneiderte Ausrüstung, die wir entwickelt haben, um die Herstellung einer solchen großen Anzahl von Proteinen erleichtern, ist eine Druckluft-Kolbenmotor, die verwendet werden, um bis zu fünf übergeben Überstände durch einen 0,22 &mgr; m Filter parallel ist.
Die Hauptklasse der Interaktionen, die vielleicht entgehen würden, wenn die Wechselwirkungen aus der Literatur (falsch negativ) erwartet im Vergleich sind homophile Interaktionen, obwohl einige dieser Interaktionen 3 nachgewiesen werden kann. In den Fällen, in denen zu erwartenden Wechselwirkungen nicht erkannt werden, glauben wir, dass dies auf die Bildung von homophile Interaktionen von den Beute-Proteine (a Beute "Maskierung"-Effekt), die dann verhindert die weitere Interaktionen mit Proteinen immobilisiert Köder ist. Die Frequenz, bei der Interaktionen erfasst hängt von dem Gehalt der Protein-Bibliothek gescreent werden. Als Leitfaden für den Leser, ein Bildschirm von> 30, 000 Wechselwirkungen innerhalb der Zebrafisch-Immunglobulin-Superfamilie resultierte in 188 Positives – eine Frequenz von 0,6% 3,16,18. Eine sehr schnelle Überprüfung vorgenommen, um die positive gespielt werden kann, ist zu überprüfen, um festzustellen, ob die Interaktion in beiden Köder-Beute-Orientierungen erfasst werden kann, dh, kann der gleiche Effekt unabhängig davon, ob die bindenden Proteine vorhanden sind detektiert werden entweder als ein Köder oder eine Beute. Wenn wir diese Hin und Herbewegung Verhalten beobachtet, hat die Bindung erfolgt wurde gezeigt, dass durch den Nachweis spezifischer direkten gesättigte Bindung der gereinigten Proteine mit Oberflächenplasmonresonanz. Es sollte betont werden, dass, weil wir Bindungsavidität erhöhen künstlich die pentamerising Beuteproteine, wir sind nicht der Ansicht des Tests für den Vergleich quantitativ Interaktion Stärken werden. Um biophysikalischen Bindungsparameter der Interaktionen verwenden wir monomeren Proteinen und Oberflächen-Plasmon-Resonanz erhalten. Schließlich, wenn eine Wechselwirkung identifiziert worden ist, die hallogh Durchsatz Art des Assays ist es relativ einfach, den Test zum Screening auf Reagenzien wie Antikörper oder kleine Moleküle, die die Interaktion blockiert anzupassen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Wellcome Trust Grant Number [077108] unterstützt, um GJW ausgezeichnet.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |