AVEXIS è un saggio di rendimento elevato di proteine di interazione sviluppate per lo screening sistematico per nuovi extracellulare del recettore-ligando coppie coinvolte in processi di riconoscimento cellulare. Si è specificamente progettato per rilevare le interazioni proteina transitori che sono difficili da identificare usando altri metodi di high throughput.
Proteina extracellulare: le interazioni tra proteine secrete o di membrana guinzaglio proteine sono fondamentali per la coesione iniziare la comunicazione intercellulare e di garantire all'interno di organismi pluricellulari. Proteine previsto per formare interazioni extracellulari sono codificati da circa un quarto di geni umani 1, ma nonostante la loro importanza e abbondanza, la maggior parte di queste proteine non hanno documentato partner di legame. Principalmente, ciò è dovuto alla loro intrattabilità biochimica: proteine di membrana-embedded sono difficili da solubilizzare nella loro conformazione nativa e contengono modificazioni post-traduzionali strutturalmente importanti. Inoltre, le affinità di interazione tra proteine recettori sono spesso caratterizzate da forze di interazione estremamente basse (emivita <1 secondo) precludendo la loro rivelazione con molti metodi abituali high throughput 2.
Qui, descriviamo un saggio, AVEXIS (Avidità-based extracellularelar Interaction Screen) che vince queste sfide tecniche che consentono la rilevazione delle interazioni proteiche molto deboli (t 1/2 ≤ 0,1 sec) con un basso tasso di falsi positivi 3. Il saggio è generalmente implementato in un formato alto rendimento per consentire lo screening sistematico di molte migliaia di interazioni in un formato conveniente micropiastra (Fig. 1). Essa si basa sulla produzione di proteine ricombinanti solubili librerie che contengono i frammenti ectodomain di recettori di superficie cellulare o proteine secrete entro il quale per schermare interazioni, pertanto, questo approccio è adatto per il tipo I, di tipo II, GPI-linked recettori di superficie cellulare e secreta proteine, ma non per le proteine di membrana multipass quali canali ionici e trasportatori.
Le librerie di proteine ricombinanti vengono prodotte usando un sistema pratico e di alto livello di espressione mammifero 4, per garantire che le modifiche post-traduzionali importanti quali glycosylazione e di legami disolfuro sono aggiunti. Espressa proteine ricombinanti sono secreti nel mezzo e prodotta in due forme: una esca biotinilato che può essere catturato su una rivestita di streptavidina fase solida adatta per lo screening, e un pentamerised enzima-tag (β-lattamasi) preda. L'esca e proteine preda sono presentati l'uno all'altro in modo binario di rilevare le interazioni dirette tra loro, analogamente a una convenzionale ELISA (Fig. 1). La pentamerisation delle proteine la preda è ottenuta attraverso una sequenza peptidica della proteina di matrice cartilaginea oligomerica (COMP) e aumenta la concentrazione locale dei ectodomains fornendo in tal modo vantaggi significativi avidità per consentire interazioni anche molto transitori da rilevare. Normalizzando le attività sia l'esca e la preda a livelli predeterminati prima della proiezione, abbiamo dimostrato che le interazioni che hanno monomeriche emivite di 0,1 sec possono essere rilevati con bassi tassi di falsi positivi 3.
Quando le cellule viventi sono osservate in vivo, le membrane plasmatiche mostrare comportamenti altamente dinamici: estendere e processi a membrana a scomparsa in quanto si mettono in contatto e comunicare con loro due vicini. Le interazioni fisiche tra le membrane-embedded proteine recettori che mediano molti di questi contatti sono evoluti per essere estremamente debole in modo da permettere questo comportamento altamente mobili. E 'stato stimato che le forze di interazione debole come monomerici 50 micron potrebbe essere sufficiente a guidare le interazioni spontanee a densità dei recettori fisiologici 9 che fa rilevare nuove interazioni estremamente impegnativi 2,10. Il metodo AVEXIS qui descritto fornisce un metodo sensibile per rilevare transitori proteina extracellulare: interazioni proteiche che possono essere implementate in maniera scalabile con un basso tasso di falsi positivi. Mentre altri metodi scalabili sono stati sviluppati per rilevare le interazioni extracellulari 11-15,Un vantaggio di AVEXIS è che i parametri sperimentali come l'esca e la preda attività sono state quantificate per rilevare anche la più debole delle interazioni (t 1/2 ≤ 0,1 s), pur mantenendo un basso tasso di falsi positivi 3. Inoltre, le procedure semplificate e robusta preparazione del campione hanno permesso questo test da attuare su una scala molto più grande di altri test e abbiamo recentemente descritto una schermata sistematica interazione ~~~HEAD=NNS un totale di oltre 16.500 potenziali interazioni 16.
Il dosaggio può essere eseguita su qualsiasi proteina per la quale è possibile esprimere un frammento solubile proteina ricombinante. Questo include pertanto proteine che contengono un peptide N-terminale come segnale di tipo I, GPI-legati e proteine secrete. Recentemente abbiamo progettato una serie di vettori che ora ci consentono di esprimere proteine di tipo II come esche 17. Il saggio non è generalmente indicato per le proteine di membrana multipass come trasportatore di ionis o pompe in quanto è improbabile che possano essere correttamente piegato al di fuori del contesto di una membrana plasmatica. Abbiamo applicato questo per una varietà di sistemi diversi e si sono espressi con successo proteine extracellulari da zebrafish 3,16,18, umano, mouse e P. falciparum per schermi di interazione.
In termini di risorse necessarie per impostare uno schermo AVEXIS, abbiamo scoperto che un collo di bottiglia significativo è la costruzione, selezione e completo sequenziamento dei plasmidi di espressione. Questo aspetto del metodo può richiedere fino a un anno per fare ~ 100 esche e costrutti prede, tuttavia, con il costo diminuzione della sintesi del gene, ora favorire commercialmente outsourcing questo aspetto del progetto. Il sistema mammifero di espressione insieme ad un grande incubatore per colture scuotimento del tessuto (si usa un cellulare Multitron INFORS HT) consente a un singolo ricercatore di esprimere e normalizzare fino a ~ 100 esche e le proteine preda di un mese. Una volta che le proteine sono prodotte e normalizzati, screening per le interazioni è rapido con fino a dodici piastre a 96 pozzetti essere convenientemente lavorati al giorno. L'apparecchiatura solo su misura che abbiamo sviluppato per facilitare la produzione di un grande numero di proteine è aria compressa-driven pistone che viene utilizzato per passare fino a cinque supernatanti attraverso un filtro 0.22μm in parallelo.
La classe principale di interazioni che potrebbero perdere rispetto alle interazioni attesi dalla letteratura (falsi negativi) sono interazioni omofili, anche se alcune di queste interazioni possono essere rilevati 3. Nei casi in cui interazioni previsti non vengono rilevati, riteniamo che questo è dovuto alla formazione di interazioni omofili dalle proteine preda (preda effetto "mascheratura") che impedisce poi ulteriori interazioni con proteine esca immobilizzate. La frequenza con cui vengono rilevate le interazioni dipende dal contenuto della biblioteca proteina sottoposta a screening. Come guida per il lettore, uno schermo di> 30, 000 le interazioni all'interno della superfamiglia delle immunoglobuline zebrafish portato a 188 positivi – una frequenza di 0,6% 3,16,18. Un controllo molto rapido che può essere eseguito per verificare eventuali colpi positivi è determinare se l'interazione può essere rilevato in entrambe esca-prede orientamenti, che è, può essere la stessa interazione rilevato indipendentemente se le proteine leganti sono presenti sia come esca o di una preda. Ogni volta che abbiamo osservato questo comportamento reciprocità, l'associazione è stato successivamente dimostrato di essere specifico, dimostrando diretto legame saturabile di proteine purificate mediante risonanza plasmonica di superficie. Va sottolineato che, poiché si aumenta avidità vincolante artificialmente pentamerising le proteine preda, non consideriamo il test adatto per confrontare quantitativamente i punti di forza di interazione. Per ottenere i parametri biofisici legame di interazione che usiamo proteine monomeriche e risonanza plasmonica di superficie. Infine, una volta una interazione è stato identificato, l'hinatura velocità gh del dosaggio rende relativamente facile adattare il saggio di schermo per reagenti quali anticorpi o piccole molecole che bloccano l'interazione.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal numero Wellcome Trust sovvenzione [077108] assegnato a GJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |