AVEXIS es una proteína de alto rendimiento ensayo de la interacción desarrollada para detectar sistemáticamente nuevos ligando extracelular del receptor de los pares que intervienen en los procesos de reconocimiento celular. Se ha diseñado específicamente para detectar las interacciones proteína transitorios que son difíciles de identificar el uso de otros métodos de alto rendimiento.
Extracelular de la proteína: proteína interacciones entre las proteínas secretadas o de membrana atados son fundamentales para la cohesión de iniciar la comunicación intercelular y la garantía dentro de los organismos multicelulares. Las proteínas predicho para formar interacciones extracelulares son codificadas por aproximadamente una cuarta parte de los genes humanos 1, pero a pesar de su importancia y la abundancia, la mayoría de estas proteínas han documentado ninguna pareja de unión. Principalmente, esto es debido a su insolubilidad bioquímicos: proteínas de membrana incrustados son difíciles de solubilizar en su conformación nativa y contienen modificaciones post-estructuralmente importantes. Además, las afinidades de interacción entre las proteínas de los receptores se caracterizan a menudo por fuerzas de interacción extremadamente bajas (vida media de <1 segundo) que impiden su detección con muchos de uso común los métodos de alto rendimiento 2.
A continuación, describimos un ensayo, AVEXIS (avidez basada extracelularlar la interacción de la pantalla) que supera estos retos técnicos que permitan la detección de interacciones proteína muy débiles (t 1/2 ≤ 0,1 segundos) con una baja tasa de falsos positivos 3. El ensayo se implementa normalmente en un formato de alto rendimiento para permitir la detección sistemática de muchos miles de interacciones en un formato de placa de microtitulación conveniente (Fig. 1). Se basa en la producción de solubles bibliotecas de proteínas recombinantes que contienen los fragmentos ectodominio de receptores de la superficie celular o proteínas secretadas dentro del cual la pantalla para interacciones, por lo tanto, este enfoque es adecuado para el tipo I, tipo II, IPM-enlazadas receptores de la superficie de células y secretada proteínas, pero no para las proteínas de membrana multipaso como los canales iónicos o transportadores.
Las bibliotecas de proteínas recombinantes se producen mediante un sistema de expresión de mamíferos cómoda y de alto nivel-4, para asegurar que las importantes modificaciones postraduccionales como glycosylabonos ción y el disulfuro se añaden. Proteínas recombinantes expresadas son secretadas en el medio y se produce en dos formas: un cebo con biotina que se puede capturar en una fase sólida recubiertas de estreptavidina adecuado para el cribado, y una enzima-etiquetado pentamerised presa (β-lactamasa). El cebo y proteínas presa se presentan entre sí en una forma binaria para detectar la interacción directa entre ellos, de forma similar a un ELISA convencional (fig. 1). El pentamerisation de las proteínas en la presa se logra a través de una secuencia de péptido de la proteína matriz oligomérica de cartílago (COMP) y aumenta la concentración local de los ectodominios proporcionando así beneficios significativos avidez para permitir interacciones incluso muy transitorios para ser detectado. Por la normalización de las actividades tanto de la carnada y la presa a niveles predeterminados anteriores a la selección, hemos demostrado que las interacciones que tienen monoméricas una vida media de 0,1 segundos se pueden detectar con bajas tasas de falsos positivos 3.
Cuando las células vivas se observan en vivo, sus membranas plasmáticas presentan comportamientos muy dinámicos: la ampliación y procesos de retracción de la membrana como se ponen en contacto y comunicarse con sus 2 vecinos. Las interacciones físicas entre las proteínas receptoras incrustados membrana que median muchos de estos contactos han evolucionado para ser extremadamente débil para permitir este comportamiento muy móviles. Se ha estimado que las fortalezas de monómeros de interacción tan débiles como 50 micras, podría ser suficiente para impulsar las interacciones espontáneas en las densidades de los receptores fisiológicos 9 lo que hace que la detección de nuevas interacciones extremadamente difíciles 2,10. El método descrito aquí AVEXIS proporciona un método sensible para la detección de la proteína extracelular transitoria: las interacciones de proteínas que pueden ser implementadas de una manera escalable con una baja tasa de falsos positivos. Mientras que otros métodos escalables se han desarrollado para detectar las interacciones extracelulares 11-15,Una ventaja de AVEXIS es que los parámetros experimentales, como el cebo y las actividades de las presas han sido cuantificados para detectar hasta el más débil de las interacciones (t 1/2 ≤ 0,1 s), manteniendo una baja tasa de falsos positivos 3. Además, los procedimientos simplificados y la muestra sólida preparación han permitido que este ensayo se realizará a una escala mucho más grande que otros ensayos y se ha descrito recientemente una pantalla de interacción sistemática total de más de 16.500 interacciones potenciales del ~ 16.
El ensayo puede realizarse en cualquier proteína de las que es posible expresar un fragmento soluble de proteína recombinante. Esto incluye tanto las proteínas que contienen un péptido señal N-terminal como el tipo I, IPM-enlazadas y proteínas secretadas. Recientemente, hemos diseñado un conjunto de vectores que ahora nos permiten expresar proteínas de tipo II como cebos 17. El ensayo no es generalmente adecuado para las proteínas de membrana multipaso como transportador de ioness o bombas, ya que es probable que se correctamente plegada fuera del contexto de una membrana plasmática. Hemos aplicado este a una variedad de sistemas diferentes y han expresado con éxito proteínas extracelulares de pez cebra 3,16,18, humano, ratón y P. falciparum para las pantallas de interacción.
En términos de los recursos necesarios para configurar una pantalla AVEXIS, hemos encontrado que un cuello de botella importante es la selección, la construcción, y la secuenciación completa de los plásmidos de expresión. Este aspecto del método puede tomar hasta un año para hacer ~ 100 cebo y construcciones de presas, sin embargo, con el costo de la disminución de la síntesis de genes, que ahora están a favor comercialmente la externalización de este aspecto del proyecto. El sistema de expresión de mamíferos, junto con una gran agitación incubadora de cultivo de tejido (se utiliza una célula Multitron Infors HT) permite que un solo investigador de expresar y normalizar hasta ~ 100 proteínas cebo y presa de un mes. Una vez que las proteínas se producen y se normalizaron, screening para interacciones es rápido con hasta doce placas 96-y siendo convenientemente procesados por día. El único equipo a medida que hemos desarrollado para facilitar la producción de un número tan grande de las proteínas es un aire comprimido impulsado pistón que se utiliza para pasar hasta cinco sobrenadantes a través de un filtro de 0.22μm en paralelo.
La clase principal de las interacciones que pueden perderse si se compara con las interacciones que se esperan de la literatura (falsos negativos) son las interacciones homophilic, aunque algunas de estas interacciones pueden ser detectadas 3. En los casos en que las interacciones esperadas no son detectados, creemos que esto se debe a la formación de las interacciones de las proteínas homophilic presa (presa de "enmascaramiento" efecto) lo que impide que las interacciones con otras proteínas cebo inmovilizados. La frecuencia a la cual se detectan las interacciones depende del contenido de la biblioteca de proteína siendo examinados. Como una guía para el lector, una pantalla de> 30, 000 interacciones dentro de la superfamilia de las inmunoglobulinas pez cebra como resultado 188 positivos – una frecuencia de 0,6% 3,16,18. Una comprobación muy rápido que se puede realizar para verificar cualquier jugado positivos es determinar si la interacción puede ser detectada en ambas presas cebo-orientaciones; es decir, la interacción puede ser detectada misma independientemente de si las proteínas de unión están presentes ya sea como un cebo o una presa. Siempre hemos observado este comportamiento alternativo, la unión ha sido posteriormente demostró ser específico mediante la demostración de la unión directa saturable de proteínas purificadas mediante resonancia de plasmón superficial. Cabe destacar que debido a que aumenta la avidez de unión artificialmente pentamerising las proteínas de la presa, no consideramos adecuado para el análisis cuantitativo comparando fuerzas de interacción. Para obtener los parámetros biofísicos de unión de las interacciones que utilizamos proteínas monoméricas y la resonancia de plasmones de superficie. Finalmente, una vez una interacción ha sido identificado, el hila naturaleza rendimiento gh de la prueba hace que sea relativamente fácil de adaptar el ensayo para la detección de los reactivos, como los anticuerpos o pequeñas moléculas que bloquean la interacción.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust, el número de subvención [077108] otorgado a GJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |