AVEXIS är en hög genomströmning av proteininteraktioner analys utvecklad för att systematiskt screena för nya extracellulära receptor-ligandpar är involverade i cellulära igenkänningsprocesser. Den är speciellt utformad för att upptäcka övergående proteininteraktioner som är svåra att identifiera med hjälp av andra massundersökningar.
Extracellulär protein: protein interaktioner mellan utsöndrade eller membran-bundna proteiner är avgörande för både initiera kommunikationen mellan och se sammanhållning i flercelliga organismer. Proteiner förutspås bilda extracellulära interaktioner kodas med ungefär en fjärdedel av mänskliga gener 1, men trots deras betydelse och överflöd, har de flesta av dessa proteiner ingen dokumenterad bindande partner. I första hand beror detta på deras biokemiska intractability: membran-inbäddade proteiner är svåra att lösa upp i sin nativa konformation och innehåller strukturellt viktiga post-translationella modifieringar. Dessutom är samspelet släktskap mellan receptor proteiner ofta kännetecknas av extremt låg interaktion styrkor (halveringstider <1 sekund) utgör hinder för deras upptäckt med många ofta använda hög genomströmning metod 2.
Här beskriver vi en analys, AVEXIS (aviditet-baserade EXtracelluLAR Interaktion Screen) som övervinner dessa tekniska utmaningar som möjliggör detektion av mycket svaga proteininteraktioner (t 1/2 ≤ 0,1 sek) med en låg falskt positivt ränta 3. Analysen genomförs vanligtvis i en hög genomströmning format för att möjliggöra systematisk screening av flera tusen interaktioner i ett lämpligt mikrotiterplatta format (Fig. 1). Det bygger på framställning av lösliga rekombinanta proteiner bibliotek som innehåller fragment ektodomän av cellytereceptorer eller utsöndrade proteiner inom vilken screena för interaktioner, och därför är denna metod är lämplig för typ I, typ II, GPI-kopplade cellytreceptorer och utsöndrade proteiner, men inte för multipass membranproteiner såsom jonkanaler eller transportörer.
Det rekombinanta proteinet bibliotek framställs med användning av en bekväm och hög nivå däggdjursexpressionssystem 4, så att viktiga posttranslationella modifieringar såsom glycosylations-och disulfidbindningarna läggs till. Uttryckta rekombinanta proteinerna utsöndras i mediet och som produceras i två former: en biotinylerad bete, som kan infångas på en streptavidin-belagd fast fas lämplig för screening och en pentamerised enzym-märkt (β-laktamas) byte. Betes-och proteiner rov presenteras till varandra på ett binärt sätt för att detektera direkta interaktioner mellan dem, liknande en konventionell ELISA (fig 1). Den pentamerisation av proteinerna i bytet uppnås genom en peptid sekvens från brosket oligomert matrix protein (COMP) och ökar den lokala koncentrationen av ektodomäner skulle innebära betydande aviditet vinster att göra det möjligt även mycket transienta interaktioner som ska detekteras. Genom att normalisera verksamhet både betet och bytesdjur till förutbestämda nivåer före screening, har vi visat att interaktioner med monomera halveringstider på 0,1 sek kan detekteras med låga falska positiva värden 3.
När levande celler observeras in vivo, deras plasmamembran uppvisar mycket dynamiska beteenden: utskjutbar processer membran som de kontakta och kommunicera med sina grannar 2. De fysikaliska interaktioner mellan de membranbundna inbäddade receptorproteiner som medierar många av dessa kontakter har utvecklats till att vara extremt svag för att medge denna mycket rörligt beteende. Man har uppskattat att monomera samspelet styrkor som svag som 50 M kan vara tillräckligt för att driva spontana interaktioner vid fysiologiska receptor densiteter 9 vilket gör att upptäcka nya interaktioner extremt utmanande 2,10. Den AVEXIS här beskrivna metoden ger en känslig metod för detektion av övergående extracellulärt protein: protein-interaktioner som kan genomföras på ett skalbart sätt med en låg falskt positivt takt. Medan andra skalbara metoder har utvecklats för att upptäcka extracellulära interaktioner 11-15,En fördel med AVEXIS är att de experimentella parametrar såsom betet och aktiviteter rov har beräknats att upptäcka även den svagaste av interaktioner (t 1/2 ≤ 0,1 s) med bibehållen låg falskt positivt ränta 3. Dessutom har de strömlinjeformade och robusta provberedningsförfaranden möjligt denna analys skall genomföras på ett mycket större skala än andra analyser och vi har nyligen beskrivit en systematisk samverkan skärm sammanlagt över ~~~HEAD=NNS 16.500 möjliga interaktioner 16.
Analysen kan utföras på vilket protein som helst för vilken det är möjligt att uttrycka ett lösligt rekombinant protein fragmentet. Detta innefattar således proteiner som innehåller en N-terminal signalpeptid, såsom typ I, GPI-länkade och utsöndrade proteiner. Vi har nyligen utvecklat en serie av vektorer som nu gör att vi kan uttrycka typ II proteiner som lockbete 17. Analysen är i allmänhet inte lämplig för proteiner multipass membran såsom jon transportörs eller pumpar eftersom de är osannolikt att vara korrekt vikas utanför ramen för ett plasmamembran. Vi har tillämpat denna på en mängd olika system och har framgångsrikt uttryckts extracellulära proteiner från zebrafisk 3,16,18, människa, mus och P. falciparum för interaktion skärmar.
När det gäller de resurser som krävs för att inrätta ett AVEXIS skärm, har vi funnit att en betydande flaskhals är valet, konstruktion och full sekvensering av uttrycksplasmider. Denna aspekt av metoden kan ta upp till ett år för att göra ~ 100 bete och konstruktioner bytesdjur, men med minskande kostnader för gensyntes vi nu föredrar kommersiellt outsourcing denna aspekt av projektet. Det däggdjursexpressionssystem tillsammans med ett stort skakning vävnadsodlingsinkubator (vi använder en INFORS HT Multitron Cell) gör en enda forskare att uttrycka och normalisera upp till ca 100 bete och proteiner rov en månad. När väl de proteiner produceras och normaliseras, screening för interaktioner är snabb med upp till tolv 96-brunnars plattor som lämpligen beredas per dag. Den enda skräddarsydd utrustning som vi har utvecklat för att underlätta produktionen av ett så stort antal proteiner är en tryckluftsdriven kolv som används för att skicka upp till fem supernatanter genom ett 0,22-filter parallellt.
Den största klassen av interaktioner som kan missas jämfört med interaktioner förväntas från litteraturen (falska negativa) är homofila interaktioner, även om vissa av dessa interaktioner kan upptäckas 3. I de fall där den förväntade interaktioner inte detekteras, tror vi att detta beror på bildningen av homofila interaktioner från de bytesproteinerna (en byte "maskerande"-effekt), som sedan förhindrar ytterligare interaktioner med immobiliserade betesproteiner. Den frekvens vid vilken interaktioner detekteras beror på innehållet av proteinet bibliotek som screenas. Som en vägledning för läsaren, en skärm av> 30000 interaktioner inom zebrafisk immunoglobulinsuperfamiljen resulterade i 188 positiva – en frekvens på 0,6% 3,16,18. En mycket snabb kontroll som kan utföras för att verifiera alla positiva träffar är att bestämma om interaktionen kan detekteras i båda bete-rov orienteringar; som kan samma interaktion detekteras oberoende av om de bindande proteinerna är närvarande som antingen ett bete eller ett byte. När vi har observerat detta fram och tillbaka beteende har bindningen därefter visat sig vara specifik genom att visa direkt mättnadsbar bindning av renade proteiner med hjälp av ytplasmonresonans. Det bör understrykas att eftersom vi ökar bindningsförmågan genom att artificiellt pentamerising bytet proteinerna vi inte anser att analysen lämpar sig för kvantitativ jämförelse interaktion styrkor. För att få biofysiska bindande parametrar interaktioner vi använder monomera proteiner och ytplasmonresonans. Slutligen, när en interaktion har identifierats, hiGH genomströmning analysens natur gör det relativt enkelt att anpassa analys för att screena för reagens, såsom antikroppar eller små molekyler som blockerar interaktionen.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Wellcome Trust licensnummer [077.108] tilldelas GJW.
Name of reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
SA-coated microtitre plates | Nunc | 734-1284 | |
OX68 antibody | AbDSerotec | MCA1022R | |
Dialysis tubing | Pierce | PN68100 | |
Polymyxin B | Sigma | P4932 | |
D-biotin | Sigma | B4639-5G | |
Substrate-104 | Sigma | 1040-506 | |
Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius | VS2002 | |
0.22 μm filters | Nalgene | 190-2520 |