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Bioengineering

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

doi: 10.3791/3884 Published: June 8, 2012

Summary

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

Abstract

Nanoparticulate 시스템은 항원 제시 세포를 1-5으로, 효율적으로 단백질을 포함하여화물을 전달하는 능력을 통해 백신 전달에 유용한 도구로 등장했습니다. 항원 제시 세포에 의해 nanoparticles의 내면화 (NP)는 캡슐화된 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 생성에 중요한 단계입니다. nanoparticle 제제 영향을 미치는 기능에 어떻게 변경 사항을 확인하려면, 우리는 internalized nanoparticles뿐만 아니라 박테리아를 검출과 호환였다 높은 처리량, 양적 실험 프로토콜을 개발하기 위해 모색하고 있습니다. 현재까지, 두 개의 독립적인 기법, 현미경 및 유동세포계측법는 nanoparticles의 phagocytosis를 연구하는 데 사용되는 방법 왔습니다. 유동세포계측법의 높은 처리량 본질은 강력한 통계 데이터를 생성합니다. 그러나, 낮은 해상도로 인해, 그것은 정확하게 셀 바운드 nanoparticles 비해 internalized 수치 실패합니다. 현미경은 높은 공간적 해상도로 이미지를 생성합니다; However, 그건 시간이 소요되며 작은 샘플 크기에게 6-8을 포함한다. 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 (MIFC)는 판상 코어를 통해 동시에 멀티 컬러 스펙트럼 형광 및 명시야 현미경 이미징을 수행하고 유동세포계측법 양쪽 측면을 통합함으로써 새로운 기술입니다. 이 기능은 형광 신호 강도와 다양한 구조와 고속 세포 기능 사이의 공간적 관계의 정확한 분석을 제공합니다.

여기, 우리는 polyanhydride의 nanoparticles이나 살모넬라 enterica serovar Typhimurium을 internalized 않은 세포 인구를 특성화하기 위해 MIFC을 활용한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 nanoparticle의 현탁액, 세포 라벨, ImageStream X 시스템의 취득 및 아이디어 응용 프로그램을 사용하여 데이터 분석 준비에 대해 설명합니다. 또한 국제화 P를 차별화하는 데 사용할 수있는 기술의 응용을 설명actin - 중재의 phagocytosis의 억제제로서 cytochalasin-D를 사용하여 nanoparticles와 박테리아 athways.

Protocol

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1. RAW 264.7 세포 배양

  1. 그들은 세포 스크레이퍼로 부드럽게 그들을 위해서 힘든하여 confluency 도달 자신 flasks에서 수확 RAW 264.7 세포. 10% 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 2 MM Glutamax,, 5 × 10 5 세포의 밀도 /도 0.5 ML 전체 Dulbecco의 수정일 독수리 매체 (cDMEM의에서 24도 세포 배양 접시에 카운트 및 플레이트 그들 10 MM HEPES)와 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 밤새 품어.

2. 병원성 살모넬라 enterica Serovar Typhimurium 14,028 변환과 문화

  1. S로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 재조합 plasmids을 소개합니다. electroporation에 의해 Typhimurium. 첫째, LB의 국물에 살모넬라 enterica serovar Typhimurium (ATCC 14028)의 문화를 준비하고 폭기와 37 ° C에서 밤새 품어.
  2. 다음날, microcentrifuge의 최대 속도로 박테리아의 펠릿 1 ML. 세포에게 구경 씻으부드럽게 각 세차 9 사이에 피펫으로 펠렛을 resuspending 지역 - 추위 맙스 / 글리세롤 용액 1 ML ((N-morpholino)의 20 % 글리세롤의 propanesulfonic 산성 (대걸레) 버퍼 1 ㎜ 3)와 UR 번. 최종 세척 후 pAKgfp1 또는 pAKgfplux1 플라스미드 DNA 0.5 μg을 낙제야 10 추가되어있는로 맙스 / 글리세롤의 50 μL에 펠렛을 resuspend.
  3. 미리 냉장 1mm의 갭 electroporation의 cuvette에 세포 현탁액을 전송하고 설정을 사용 electroporate : 1800 V, 200 W, 25 MF합니다. 즉시 펄스 전송 후, LB의 국물 1 ML을 추가하고 새로운 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송. 세포 폭기와 37 ° C에서 복구를 허용합니다. 일시간 후 남은 뜨는의 ~ 100 μL의 원심 분리하고 resuspend하여 세포를 집중.
  4. 마지막으로, 판 100 μg / ML 암피실린 37에서 밤새 품어을 포함한 LB 플레이트에있는 세포 ° C. 단일 콜로니는 GFP 전의 항생제 선택과 표현으로 restreaking에 의해 정화된다S는 표준 플루오레신 isothiocyanate (FITC) 필터 세트와 조명에 의해 확인했다.
  5. 안정적으로 고속 GFP로 변모되었습니다 살모넬라균의 loopful 25 μg / ML 암피실린 (또는 적절한 항생제)이 포함된 LB의 국물의 10 ML의 예방.
  6. 37에서 하룻밤 박테리아를 성장 ° C.
  7. 37 5 H에 대한 암피실린 및 부화로 보충 10 ML의 LB ° C를 포함하는 새로운 문화 튜브에 살모넬라균의 1시 10분를 희석
  8. 600 NM에서 문화의 흡광도를 측정하고 이전에 성장 곡선을 수립 이용한 ML 당 살모넬라균의 농도를 계산.
  9. RAW 264.7 세포 당 100의 감염의 다수를 (방어)을 구하는 데 cDMEM (0.5 ML / 음)에 살모넬라균을 희석.

3. Nanoparticle 서스펜션의 작성

  1. 이전 11 설명된대로 1% FITC-로드된 nanoparticles를 조작. 간단히, 입자 polyanhydride에 의해 가공된다폴리머는 메틸렌 클로라이드에 녹아있는 (4 ° C에서 25 밀리그램 / ML의 농도에서)과 pentane (pentane 비율 1:200 메틸렌 클로라이드에서 -30 ° C)에서 시켰던되는 안티 솔벤트 nanoencapsulation. 진공 여과에 의해 nanoparticles를 복구할 수 있습니다. 모든 잔류 용매를 증발 후 말린 polyanhydride는 소독하는 것은 종이의 무게를 사용하여 nanoparticles 무게.
  2. 차가운 인산 0.5 ML에 nanoparticles의 5 밀리그램을 추가 염분은 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (PBS, 칼슘 및 마그네슘 무료, 산도 7.4) 버퍼와 nanoparticles가 RAW 264.7 세포에 추가되기 전까지 얼음에 보관하십시오.
  3. 4-6 쥴로에서 약 25 s에 대한 microtip 들으며 초음파 액체 프로세서를 사용하여 nanoparticle 현탁액을 (얼음 유지하면서) Sonicate.

4. Phagocytosis 분석

  1. 매체와 repl를 aspirating하여 사전 NP이나 살모넬라균의 도입 5 μg / ML cytochalasin-D를 1 시간으로 RAW 264.7 세포의 하위 집합을 Pretreat억제제와 보충 신선한 cDMEM로 acing. 37 ° C 배양기에 문화를 반환합니다.
  2. 억제제와 1 H 보육 후, 인큐베이터에서 접시를 제거 와동 nanoparticle 서스펜션, 그리고 적절한 우물에 10 μL를 추가합니다.
  3. 와동 살모넬라균하고 적절한 우물에 세균을 추가하여 방어 100과 RAW 264.7 세포를 감염.
  4. 37에서 믹스 앤 부화 판을 몇 번 누르 ° C 또는 45 분 4 ° C (컨트롤).
  5. 보육 또는 얼음에서 냉장고와 장소에서 접시를 제거합니다. 얼음 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻어 (CA이없이 + 및 MG 2 +) aspirating 및 폐기 언바운드 입자, 살모넬라균, 그리고 사망 또는 단독 RAW 264.7 세포를 제거하는 기존의 매체에 의해.
  6. 두 번째 세척 후 RAW 264.7 세포를 수확하기 위해 얼음처럼 차가운 PBS 250 μL를 추가하고 부드럽게 우물을 다쳤어요.
  7. 맑은 뷰 스냅 캡 마이크로으로 Pipet 수확 세포튜브를 원심 분리기 얼음 위에 보관하십시오.
  8. 4에 10 분 250 X g에서 1 차가운 세척 버퍼의 ML (2 % 열 inactivated FBS, PBS에 0.1 %의 나트륨 azide)와 원심 분리기를 추가 ° C를하여 세포를 씻으
  9. 뜨는을 취소하고 종이 타월에 거꾸로 microcentrifuge 튜브를 도청하여 잔류 버퍼를 제거합니다. 부드럽게 테스트 튜브 랙에 걸쳐 microcentrifuge 튜브를 긁어하여 세포 펠렛을 Resuspend.
  10. PBS에서 4 % paraformaldehyde 100 μL (PFA)를 추가하고 세포가 실내 온도 (RT)에서 15 분 동안 서있게하여 RAW 264.7 세포를 수정합니다.
  11. 4에 10 분 250 X g에서 1 파마 / 워시 버퍼의 ML (BD Biosciences)와 원심 분리기를 추가 ° C를하여 RAW 264.7 세포를 씻으
  12. 4.9 단계를 반복합니다.
  13. RT에서 15 분 동안, 알렉사 형석 phalloidin 660 (1:150 희석 AF 660)를 포함하는 파마 / 워시 버퍼의 100 μl를 추가하여 actin의 RAW 264.7 세포 청바지. 단계 4.11와 4.12를 반복합니다.
  14. 50 μL의 RAW 264.7 세포를 ResuspendPBS는 인수까지 1퍼센트 PFA 4에서 어둠 속에서 그들을 저장할 ° C를 포함하는.

팁 & 참고 사항 :

  • 단일 색상의 형광 샘플은 ImageStream X 악기를 설정하는 동안 보상 컨트롤로 사용하려면이 단계에서 준비되어야한다. ; RAW 264.7 세포 (actin에 대한 분류되지 않음) 살모넬라와 incubated; actin에만 레이블 RAW 264.7 세포 RAW 264.7 세포 (actin에 대한 분류되지 않음) nanoparticles와 incubated : 보상였다 본 실험에 포함 제어합니다.
  • 억제제 연구를 위해, 억제제가 컨트​​롤로 해체하는 차량 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 본 실험에서는 cytochalasin-D는 100 % DMSO에 용해되었다. 우리는 그러므로 cDMEM 함유 DMSO를 입력한 다음 incubated 전지 nanoparticles이나 살모넬라균의 내면화를 평가했다. 우리는 중간 그룹과 DMSO 제어 (데이터가 표시되지 않음) 사이에 큰 차이를 감지하지 않았다.
  • SAAmnis 웹사이트 (에서 사용 가능한 mple 준비 가이드 https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf는 ) ImageStream X와 fluorophores의 호환성을 확인하기위한 좋은 자원입니다. 이 문서에 액세스하려면 사용자는 먼저 Amis으로 (무상) 등록해야합니다.

5. ImageStream X에서 샘플 수집

  1. ImageStream X 및 개시 최대 파워 고무.
  2. Fluidics을 초기화합니다. 이 스크립트 Speed​​Beads의 끝에 실행해야합니다.
  3. 파일 메뉴에서 기본 템플릿을로드를 선택합니다.
  4. 이미지 갤러리보기 메뉴에서 모두 선택하고 이미지 비즈를 시작하려면 설치 프로그램을 실행을 누릅니다.
  5. 코어 laterally 중심 이미지 (필요한 경우)를 추적 조정합니다.
  6. Brightfield (BF) 채널을 선택하고 설정 강도를 누릅니다.
  7. 흐름 속도 이력서가 일관되게 르 때까지 기다려0.2 %보다 SS.
  8. 매일 악기를 보정. 도움이 탭에서 클릭하여 교정 및 테스트를 실행하는 모든 시작하고 모두 통과했는지 확인합니다.
  9. 첫 번째 예제를로드 플러쉬 전투 준비 태세 (FLL)를 누르십시오. 각 fluorochrome와 fluoresces 사용한 실험에서 가장 밝은 샘플을로드합니다. 그것은 당신이 전체 실험을 위해 그들을 변경하지 마십시오 후 악기 설정을 확립하기 위해 먼저이 샘플을 실행하고 매우 중요하다.
  10. 실험에 사용된 각각의 레이저의 전원을 켜고 각 fluorochrome가 최대 픽셀 값이 같은 분산형 플롯로 측정 100 사이와 4,000 건의을 가지고 있으므로 레이저 파워를 설정합니다.
  11. 원치 않는 개체의 컬렉션을 제거하기 위해, 세포 분류 기준을 설정합니다. 오직 세포에서 데이터를 수집하기 위해, 50 μm의에 BF 채널의 영역 하한선을 선택합니다. 50 μm의 미만의 면적 객체는 파편으로 간주되며 취득되지 않습니다. 수집하는 채널을 선택합니다.
  12. 파일 이름, 대상 폴더, 설정 순서를 입력하십시오# 1과 인수 이벤트의 수입니다.
  13. 첫 번째 실험 데이터 파일을 수집하고 저장 습득 실행을 클릭합니다.
  14. FLL을 클릭하고 다음 실험 샘플을 실행합니다. 모든 실험 샘플을 수집 때까지 반복합니다.
  15. 검색 설정 (brightfield 및 분산형 레이저 해제하고 모든 채널의 수집을 가능하게) 클릭하고 보상 행렬을 개발하는 실험에서 각 형광단 각 단일 스테인드 샘플에서 500 긍정적인 세포를 수집합니다.

요약하면, 샘플은 다음과 같은 순서로 실행할 수 있습니다 :

  • 첫째 밝은 샘플.
  • 남은 테스트 샘플.
  • 보상은 단일 색상의 형광을 포함하는 제어합니다.

팁 & 참고 사항 :

  • 영감 템플릿이 저장되고 악기 설정을 설정하려면 다시로드 할 수 있습니다. 일단 템플릿이 저장되며, autosampler은 한 템플릿과 공동으로 실험용 샘플을 실행하려면 무인 작업을 위해 사용될 수 있습니다mpensation 각 단일 색상 컨트롤을위한 템플릿으로 제어합니다.
  • 이러한 실험을위한 ImageStream X 구성 : 488과 658 나노미터 여기 레이저, 785 나노미터 분산형 레이저, 40X (NA 0.75) 목표, 표준 ISX 필터 스택, 6 채널 시스템입니다. autosampler 옵션은 샘플 무인 취득을 허용하는 데 사용되었다.
  • 다음과 같은 설정이 실험을 위해 사용되었습니다. Nanoparticles이 10mW로 설정된 488 nm의 레이저로 몇 군데 있었는데, 658 nm의 레이저가 50 MW로 설정, 785 nm의 레이저는 채널 1에서 2 MW와 BF로 설정합니다. 살모넬라균에 감염된 세포는 20 MW로 설정된 488 nm의 레이저로 몇 군데 있었다 658 nm의 레이저가 50 MW로 설정, 785 nm의 레이저 채널 1에서 2 MW, 그리고 BF로 설정합니다. 보상 컨트롤 BF와 785의 부재에서 수집되었다. 적어도 5000 이벤트 (즉, 세포가) 시험 시료마다 몇 군데 있었다.

6. 이미지 분석

  1. 아이디어를 실행하고있는 내면화 마법사와 하중을 두 번 클릭테스트 샘플의 전자. rif 파일.
  2. 2 단계에서 '새 매트릭스'를 클릭하여 보정 매트릭스를 만듭니다. 보상 마법사가 시작됩니다. 실험에서 단일 색상 컨트롤에 대한 파일을 추가합니다. 보상 행렬 파일이 저장되고 내면화 마법사의 2 단계의 상자에로드 될때까지 지시에 따라 마법사를 통해 다음을 클릭하십시오.
  3. 다음을 클릭하고. DAF 파일이 생성 될때까지 지시를 따릅니다.
  4. 획득시 사용되는 이미지 채널을 선택하여 이미지 디스플레이 등록 정보를 설정합니다. 채널 2 (FITC)와 채널 5 (AF 660)를 클릭하십시오. (BF와 SSC가 기본 선택되어 있습니다.)
  5. 셀 경계 (CH01)과 nanoparticles이나 박테리아가 수집되었다되는 채널 (CH02)를 만들기위한 이미지 채널을 선택합니다.
  6. 세포의 모든 Brightfield의 ​​화면 비율 대 Brightfield 지역의 분산형 음모가 생성됩니다. singlets 주위 개별 점 및 게이팅를 클릭하여 단일 세포 인구를 정​​의합니다. 단일 세포의 화면 비율을 가지고1 라운드와 0.5 (그림 1A) 주위 doublets.
  7. Brightfield의 그라데이션 루트의 히스토그램 brightfield 이미지의 스퀘어 (RMS)가 생성되며 이미지 갤러리의 인구 전망이 선택 상자 (그림 1B)로 설정되어 평균입니다. 최상의 초점에서 세포가 시작하고 게이트 주력 전지로 라인 영역을 그릴 위치를 결정하는 방식을 클릭합니다. 높은 그라데이션 RMS는 집중수록 좋습니다. 당신의 게이트로 원하는 다른 얼룩이가 없으면 다음 단계를 건너 뛰십시오.
  8. y 축은에 Ch2의 X 축 대 최대 픽셀의 채널 2 세기의 새로운 분산형의 줄거리는 (그림 1C)가 생성됩니다. 점들을 클릭하고 nanoparticles이나 박테리아 양성 반응 세포가 주변 지역을 그릴 수 있도록 이미지를 볼 수 있습니다.
  9. 국제화 기능의 히스토그램은 이미지 (그림 1D)를 관찰하여 조정한다 0부터 시작 지역으로 생성됩니다. 국제화 기능의 비율입니다전체 세포의 농도로 세포 내부의 강도. 이것은 강도의 절반 정도의 값을 0으로 내부는 것을 같은 크기를 조정합니다. 마법사는 세포 표면을 찾기 위해 5 단계에서 세포 이미지 입력​​을 사용하고 4 픽셀하여이 작업을 침식했다 마스크를 제작하여 내부를 지정할 영역을 만들었습니다. 이 마스크를 수동으로 다른 세포 유형에 필요한 경우에 맞게 변경해야합니다. 본 실험에서는 수동으로 먼저 brightfield 이미지에서 객체 마스크를 생성하여 기능을 조정하며 4 픽셀하여이 작업을 침식. 국제화 기능은 다음이 4 픽셀 침식된 객체 마스크를 기반으로 계산되었다. 이 기능은 우리가 마스크 경계 (그림 2) 외부 그들의 형광 신호의 대부분이 표면에 바인딩된 입자와 박테리아에서 마스크 경계 내에서 형광 신호의 대부분을 가지고 internalized 입자와 박테리아를,,, 구별할 수 있습니다.
  10. 유한 요소 분석법 새로운 국제화와 새로운 히스토그램 만들기침식된 객체 마스크를 기반으로 진짜야. 선택한 빈 모드에서 이미지를 보면 internalized 세포 게이트로 영역을 그립니다. 우리의 실험에서 우리는 0.3에서이 게이트를 설정합니다. 0.3보다 낮은 점수와 세포 표면에 바인딩된 입자 긍정적인 세포로 간주되었다.
  11. 마지막으로, 배경 라벨링과 세포를 제거하고 특정 internalized nanoparticles이나 세균을 식별하는 데, 아이디어 명소 카운트 기능이 사용되었습니다. 스팟 개수는 연결된 구성 요소 또는 이미지의 작은 마스크의 수를 카운트 기능입니다. 마스크 기능, 스팟, 피크와 강도는 반점을 정의하는 데 사용되었다. 스폿 마스크는 사용자가 지정한 반경과 지역 배경 위의 요건을 갖게되는 이미지의 밝은 세부 사항을 발견, 마스크 200 카운트의 강도 위의 피크 함수가 다음 장소를 사용하여 각각의 관광 명소로 높은 농도를 분리 위반하여 세련되고이 포함되었다 . 자세한 사항은 (그림 1E)에 대한 Amnis 현장 마스킹 안내서를 참조하십시오. 통계를 다시 포트 템플릿은 보고서 메뉴의 다양한 기능을 포함 의해 생성되었다.
  12. 템플릿 파일은 모든 실험 파일의 배치 분석에 사용되는로이 파일이 저장되었습니다.
  13. 아이디어 소프트웨어에서 도구에게 → 배치 데이터 파일 및 입력 다. rif 파일을 클릭합니다. 보상 행렬 파일 (. CTM) 및 해당 섹션의 템플릿 파일 (. 대서양 표준시)에 추가합니다. 처리 배치를 제출한다. 처리 단계가 끝나면 모든. rif 파일은 분석하고있다. DAF 파일은 각각의 RAW 파일 각각에 대해 생성됩니다. 최종 보고서 파일은 모든 샘플에 대한 통계와 함께 생성됩니다.

팁 & 참고 사항 :

  • 이미지 분석은 아이디어 소프트웨어 버전 4.0 및 일부 수정 내면화 마법사를 사용하여 수행되었다. 마법사는 자기 될지는이며 ouptput. DAF 파일은 마법사의 지침에 따라 생성할 수 있습니다.

7. 대표 결과

"> 그림 2의 대표적인 이미지는 그 MIFC이 성공적으로 internalized (왼쪽 패널)을 구별하는 데 사용할 수 입증 대 것은 표면 바운드 (오른쪽 패널) NP (그림 2A)이나 살모넬라균 (그림 2B). NP과 살모넬라균의 내면화가 감소되었다 억제 actin과 4 ° C (그림 3A)로 온도를 낮추면 모두. 행 표면에서 양성 세포의 비율은 NP (중 cytochalasin-D 또는 4 ° C에서 치료 후보다 큰 35 % 37 ° C에서 약 8 %에서 증가 그림 3B)가. 반대로, 표면 바운드 살모넬라균과 세포의 비율은 cytochalasin-D 처리에 따라 35% ~ 15 %에서 감소되었다. 4에 살모넬라와 RAW 264.7 세포의 배양 ° C는 양을에서 뚜렷한 증가없이 내면화 감소 37 ° C 제어에 비해 표면이 박테리아를 묶고. 함께, 이러한 데이터는 것을 보여주 <그들은> 살모넬라와 NP는 actin가 필요하며 온도 의존 유사한 세포 과정에서 internalized됩니다. 또한, 데이터 macrophages에 살모넬라균의 지속적인 첨부 파일이 actin의 중합을 필요로 나타냅니다.

그림 1
1 그림. 표면 바운드 nanoparticles과 살모넬라균 비해 internalized 결정하기 위해 활용 게이팅 전략의 개략도. () 하나의 세포로 분석을 제한하기 위해, 그것은 파편과 멀티 셀룰러 이벤트를 제거하는 것이 중요합니다. 단일 세포 doublets는 아이디어 기능 영역과 brightfield 이미지 (M01)의 가로 세로 비율을 사용하여 다세포 합산에서 분리되었다. doublets은 일반적으로 aspe을 가지고, 면적은 평방 미크론와 화면 비율의 이미지의 크기 것은 주요 축을 따라서 순환성의 측정 (완벽한 원이 1의 가로 세로 비율을해야합니다으로 나눈 작은 축입니다중부 표준시의 주위의 비율 0.5과 다세포 집계)은 일반적 미만 0.5입니다. 지역은 단세포 이벤트 (6.6 단계)의 게이트에 그립니다. (B) - 초점의 세포에 검은 아이디어 brightfield 이미지의 그라데이션 RMS는 히스토그램으로 꾸몄다되는 기능이 있습니다. 그라데이션 RMS 기능은 이미지에 픽셀 값의 변화를 감지하여 이미지의 선명도 품질을 측정합니다. 높은 그라데이션 RMS 값이 좀 더 집중된 이미지 (6.7 단계)을 나타냅니다. (C) 녹색 형광 양성 세포는 높은 최대 픽셀 가치와 녹색 형광 채널 (6.8 단계)의 강도와 세포의 게이팅 선정되었다. (D) internalized NP이나 살모넬라균과 세포는 동등 또는 0.3 이상의 내면화 점수와 세포 인구를 선택하여 선정되었다. 점수 미만 0.3을 수신 세포 표면 (6.9 단계) 의무로 간주되었다. (E) "internalized"게이트에있는 세포는 더 반점의 개수 (NP 또는 STM) 때문에 군터을 바탕으로 특성화되었습니다e는 internalized으로 산정되었습니다 배경 염색법과 어떤 세포했지만 영 (단계 6.11)의 자리 값을했다. 대표 이미지는 각 게이트에 대해 표시되는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 2
그림 2. internalized 및 표면 바운드 nanoparticles (NP) 또는 살모넬라균의 세포 이미지. () internalized NP (왼쪽 패널)와 세포 NP 자신의 표면에 바인딩지만 (오른쪽 패널) internalized되지 않았습니다하는 것이 RAW 264.7 세포의 대표 이미지. (B) internalized 살모넬라균 (왼쪽 패널)와 세포 살모넬라균 그들의 표면에 바인딩지만 (오른쪽 패널) internalized되지 않았습니다하는 것이 RAW 264.7 세포의 대표 이미지.

그림 3
그림 3. Cytochala세포의 속죄 차원 치료 NP과 살모넬라균의 내면화를 저해. cytochalasin-D와 RAW 264.7 세포 () 전처리 중간에 37 ° C에서 incubated RAW 264.7 세포에 비해 또는 4의 배양은 ° C가 NP이나 살모넬라균 내면화의 발병률을 감소. DMSO를 (즉, 차량 통제)가 포함된 배지에서 incubated RAW 264.7 세포는 혼자 매체 (데이터가 표시되지 않음)에 비해 NP과 살모넬라균에 대해 유사한 국제화 수준을 보여주었다. (B) cytochalasin-D와 RAW 264.7 세포의 전처리는 표면 바운드 살모넬라균과 세포의 %가 감소하면서 표면이 NP 묶여있는 세포의 비율을 증가했다.

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Discussion

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연구는 폴리 (락트 - 공동 glycolic 산 (PLGA) 또는 polyanhydrides을 기반으로 생분해성 nanoparticles는 대상 세포를 캡슐 항원이나 약물을 전달하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. phagocytic 세포에 의해 이러한 nanoparticles의 이해 이렇게 양적으로 만들어 그들의 효과를 위해 중요하다 . 소설 nanoparticle 전달 시스템을 설계에서 중요한 내면화의 분석이 방법을 사용함으로써는 다양한 세포 유형별로 nanoparticles의 차등 이해가 쉽게 분석할 수 있으며, 종래의 현미경 및 유동세포계측법 데이트를하려면 입자 이해를 quantifying에 사용되었습니다;.하지만, 각각의 높은 처리량 및 내면화를 공부하는 다른 접근 방법을위한 해상도의 호출로 제한.이 문서에서 우리는 특성화와 phagocytosis의 생물 학적 과정 목표 - 세균성 병원체 및 합성 nanoparticles의 두 유형 간의 차이가 어떻게 비교할 MIFC 분석을 수행합니다.

MIFC phagocytos검정은 nanoparticles에 비해 살모넬라균의 이해의 기본 메커니즘의 차이를 윤곽을 그리다하는 데 사용되었다한다. 그것은 에페들이 배양 시간과 농도에 따라 세포 독성이 될 수 있다고 지적한다, 따라서 이전에 세포 독성 프로 파일링 (즉, 노출 시간 및 농도)의 사용 13,14 전에 필요합니다. 그들의 화학적 제제에 따라 nanoparticles는 유리 전이 온도 (TG = 13 ° C) RT 아래를 가질 수 있습니다, 결과적으로, 그들은 RT 15시 집계를 형성하고 있습니다. 집계를 극복하기 위해 우리는 입자를 sonicated과 세포 배양과 더불어 이전 빙판에 갖고 있어요. nanoparticle의 이해의 운동 연구는 항원 제시 세포로 캡슐화된 페이로드를 제공하는이 입자의 효율성에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 관리가 더욱 세포 프로세스를 억제하기 위해 주어진 시점의 끝에 얼음 세포를 유지하기 촬영해야합니다. 이를 위해, 우리는 cellula의 다양성을 언급했습니다세포가 얼음에 게재되지 않은 R은 이해. 위에서 설명한 방법 중 하나는 제한이 실험이 phagocytic 세포를 수확하는 기술 부서가 필요 자기편 세포에서 수행되고있다는 것입니다. 이 절차를 따라서 데이터 분석의 일부 오류를 도입, 세포 사망을 초래할 수 있습니다. 우리가 여기에서 설명하는 절차도 정지 성장 세포를 사용하여 수행할 수 있습니다.

반응성 염료 또는 immunolabeling의 시약과 macrophages의 인큐베이션은 잔여 버퍼 현재 다음과 같은 고정의 양을 줄임으로써 최적화되었다. 잔여 버퍼의 존재는이를 일관 평균 형광 강도 값의 결과로, 희석 효과를 만들고 여러 샘플 간의 샘플 변화에 샘플을 생성할 수 있습니다. 샘플 농도 (즉, 세포 / ML)도 더 이상 실행 시간에 묽은 샘플 결과로, 수집 단계에서 고려해야 할 중요한 요소입니다. 다른 사이의 다중 파라메 트릭 비교실험 샘플, 그것은 레이저 강도를 일정하게 유지하는 것이 중요합니다.

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Disclosures

Sherree L. 친구는 ImageStream의 X 시스템을 제조 Amnis 회사에 의해 고용된다.

Acknowledgments

저자는 금융에 대한 ONR-MURI 수상 (NN00014-06-1-1176)과 미군 의료 연구 및 Materiel 명령을 (부여 번호 W81XWH-09-1-0386 및 W81XWH-10-1-0806) 감사드립니다 지원합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RAW 264.7 cell line American Type Culture Collection (ATCC) TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S 11150 Premium Grade
Glutamax GIBCO, by Life Technologies 35050-061
HEPES GIBCO, by Life Technologies 15630-080
24-well plate Techno Plastic Products 92024
Cell culture Flasks Techno Plastic Products 90151
Cell scraper Techno Plastic Products 99002 24 cm
Salmonella entericaserovar Typhimurium ATCC 14028
BTX ECM630 Electro Cell Manipulator BTX Technologies
MOPS Fisher Scientific BP308
Phosphate buffered saline (PBS) Cellgro 21-040-CV
Ultrasonic liquid processor Misonix S-4000
Cytochalasin-D Sigma-Aldrich, C8273
Formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Wash buffer 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS.
Perm/wash buffer BD Biosciences 554714
Clear-view snap cap microtubes Sigma-Aldrich T4816
Alexa Fluor phalloidin 660 Invitrogen A22285
ImageStreamX Amnis Corporation 100200 Options: 658nm laser, autosampler
Sodium azide Fisher Scientific S 227I-500

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References

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멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석
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Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., Phillips, G. J., Narasimhan, B., Wannemuehler, M. J., Bellaire, B. H. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884, doi:10.3791/3884 (2012).More

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