Summary
In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.
Abstract
Nanodeeltjes systemen naar voren zijn gekomen als waardevolle instrumenten in de toediening van vaccins door hun vermogen om efficiënt te leveren goederen, waaronder eiwitten, aan antigeen presenterende cellen 1-5. Internalizatie van nanodeeltjes (NP) door antigeen-presenterende cellen een belangrijke stap in het genereren van een effectieve immuunrespons de ingekapselde antigeen. Om hoe veranderingen in nanopartikelformulering invloed functie te bepalen, hebben we getracht een high throughput, kwantitatieve experimentele protocol dat in overeenstemming was met het opsporen van geïnternaliseerde nanodeeltjes evenals bacteriën te ontwikkelen. Tot op heden zijn twee onafhankelijke technieken, microscopie en flowcytometrie, zijn de methoden die worden gebruikt om de fagocytose van nanodeeltjes te bestuderen. De high throughput aard van flowcytometrie genereert robuuste statistische gegevens. Echter, als gevolg van lage resolutie, is niet nauwkeurig te kwantificeren geïnternaliseerd versus cel gebonden nanodeeltjes. Microscopie genereert beelden met een hoge ruimtelijke resolutie, hHof toevoegde, het is tijdrovend en het gaat om kleine steekproeven 6-8. Multi-spectrale beeldvorming flowcytometrie (MIFC) is een nieuwe technologie die aspecten van zowel microscopie en flowcytometrie dat multi-color spectrale fluorescentie en helder field imaging voert tegelijkertijd door middel van een laminaire kern opgenomen. Deze mogelijkheid biedt een nauwkeurige analyse van fluorescent signaal intensiteiten en ruimtelijke relaties tussen verschillende structuren en cellulaire functies op hoge snelheid.
Hierin beschrijven we een methode gebruik te maken van MIFC om de celpopulaties die zijn geïnternaliseerd polyanhydride nanodeeltjes of Salmonella enterica serovar Typhimurium karakteriseren. We beschrijven ook de voorbereiding van nanodeeltjes suspensies, cel-etikettering, de verwerving van een ImageStream X-systeem en de analyse van de gegevens met behulp van het IDEAS-toepassing. Ook tonen de toepassing van een techniek die kan worden gebruikt om de internalisatie p onderscheidenathways voor nanodeeltjes en bacteriën door het gebruik cytochalasine-D als een remmer van actine-gemedieerde fagocytose.
Protocol
1. RAW 264,7 Cel Cultuur
- Harvest RAW 264.7 cellen van hun kolven wanneer zij confluentie door schrapen ze voorzichtig met een cel schraper. Graaf en plaat ze in een 24 goed celkweek schotel bij een dichtheid van 5 x 10 5 cellen / putje in 0,5 ml volledig Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM, 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 2 mM Glutamax, en 10 mM HEPES) en overnacht bij 37 ° C incuberen in 5% CO2 incubator.
2. Pathogene Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028 Transformatie en Cultuur
- Stel recombinant plasmiden green fluorescent protein (GFP) te S. Typhimurium door elektroporatie. In de eerste plaats voor te bereiden cultuur van Salmonella enterica serovar Typhimurium (ATCC 14.028) in LB-bouillon en incubeer overnacht bij 37 ° C met beluchting.
- De volgende dag pellet 1 ml bacteriën bij maximale snelheid in een microcentrifuge. Was de cellen four keer met 1 ml koud MOPS / glycerol oplossing (1 mM 3 - (N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS) buffer in 20% glycerol) voorzichtig resuspenderen de pellet met een pipet tussen elke wassing 9. Na de laatste wassing, mengen van de pellet in 50 ul MOPS / glycerol waarin op ~ 0,5 ug pAKgfp1 of pAKgfplux1 plasmide DNA werd toegevoegd 10.
- Breng de celsuspensie naar een vooraf gekoeld 1 mm afstand elektroporatie cuvet en electroporate behulp van de instellingen: 1800 V, 200 W, 25 mF. Onmiddellijk na de puls levering, voeg 1 ml LB bouillon en breng de celsuspensie om een nieuw 15 ml buis. Laat de cellen bij 37 ° C herstellen met beluchting. Na een uur concentreren cellen door centrifugeren en hersuspenderen in ~ 100 pi resterende supernatant.
- Tenslotte plaat de cellen op LB-platen met 100 pg / ml ampicilline en incubeer overnacht bij 37 ° C. Single kolonies worden gezuiverd door restreaking met antibiotica selectie en de expressie van GFP is bevestigd door belichting met een standaard fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) filter set.
- Inoculeer 10 ml LB-medium dat 25 microgram / ml ampicilline (of geschikte antibiotica) een entoog met bacterie Salmonella die is getransformeerd stabiel express GFP.
- 'S nachts groeien de bacteriën bij 37 ° C.
- Verdun Salmonella 01:10 een verse kweek buis met 10 ml LB aangevuld met ampicilline en incubeer 5 uur bij 37 ° C.
- Meet de absorptie van de cultuur bij 600 nm en de concentratie van de Salmonella per mL behulp van een eerder groeicurve stellen.
- Verdun de Salmonella in cDMEM (0,5 ml / putje) een veelvoud van infectie (MOI) van 100 per RAW 264,7 cel te verkrijgen.
3. Voorbereiding van Nanodeeltje Suspension
- Fabriceren 1% FITC geladen nanodeeltjes zoals eerder 11 beschreven. In het kort worden deeltjes vervaardigd door polyanhydrideanti-oplosmiddel nanoencapsulation, waarin het polymeer opgelost in methyleenchloride (4 ° C bij een concentratie van 25 mg / ml) en neergeslagen in pentaan (-30 ° C in een verhouding 1:200 methyleenchloride: pentaan). Recover nanodeeltjes door vacuüm filtratie. Na het verdampen van eventueel resterende oplosmiddel, wegen de gedroogde polyanhydride nanodeeltjes door middel van gesteriliseerd wegen papier.
- Voeg 5 mg van nanodeeltjes tot 0,5 ml koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, calcium en magnesium vrij, pH 7,4) in 1,5 mL microcentrifugebuis en houden op ijs tot de nanodeeltjes toegevoegd RAW 264,7 cellen.
- Bewerk met ultrasone trillingen de nanodeeltjes suspensie (terwijl op het ijs) met behulp van een ultrasone vloeistof-processor voorzien van een microtip voor ongeveer 25 sec op 4 tot 6 joules.
4. Fagocytose Assay
- Voorbehandelen een subset van RAW 264,7 cellen met 5 pg / ml cytochalasine-D 1 uur vóór de invoering van NP of Salmonella door opzuigen medium en replacing met verse cDMEM aangevuld met de remmer. Zet de culturen tot 37 ° C incubator.
- Na 1 uur incubatie met de remmerfractie Verwijder de platen van de couveuse vortex de nanodeeltjes suspensie wordt 10 pi van de geschikte putjes.
- Vortex de Salmonella en infecteren de RAW 264.7 cellen met een MOI van 100 door het toevoegen van de bacteriën naar de juiste bronnen.
- Raak de plaat aantal malen te mengen en incuberen bij 37 ° C en 4 ° C (controle) gedurende 45 minuten.
- Verwijder de platen uit de couveuse of koelkast en leg ze op ijs. Twee keer Spoel de cellen met ijskoude PBS (zonder Ca 2 + en Mg 2 +) door opzuigen en zich ontdoen van het oude medium om ongebonden deeltjes, Salmonella, en dode of vrijstaande RAW 264.7 cellen te verwijderen.
- Om de RAW 264.7 cellen oogsten na de tweede wasbeurt, voeg 250 ul van ijskoude PBS en voorzichtig schrapen de putten.
- Pipetteer de geoogste cellen in doorkijkmasten klikdop microcentrifuge buizen en houd ze op ijs.
- Was de cellen door toevoeging van 1 ml koud wasbuffer (2% hitte geïnactiveerd FBS, 0,1% natriumazide in PBS) en gecentrifugeerd bij 250 x g gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en verwijderen resterende buffer door te tikken op de omgekeerde microcentrifugebuis op keukenpapier. Resuspendeer de celpellet door voorzichtig harken de microcentrifugebuis in een reageerbuis rek.
- Zet de RAW 264,7 cellen door toevoeging van 100 pi 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS en kunnen de cellen gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT).
- Was de RAW 264,7 cellen door toevoeging van 1 ml Perm / wasbuffer (BD Biosciences) en gecentrifugeerd bij 250 x g gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Herhaal stap 4.9.
- Vlek RAW 264,7 cellen actine door toevoeging van 100 ul Perm / wasbuffer met Alexa Fluor phalloidin 660 (AF 660; 1:150 verdunning) gedurende 15 min bij KT. Herhaal stap 4.11 en 4.12.
- Resuspenderen RAW 264,7 cellen in 50 ulPBS met 1% PFA en opslaan in het donker bij 4 ° C tot acquisitie.
Tips & Opmerkingen:
- Een kleur fluorescentie monsters moeten worden voorbereid op deze stap om te worden gebruikt als compensatie controles tijdens het instellen van de ImageStream X-instrument. De compensatie regelt in dit experiment waren: RAW 264,7 cellen (niet gelabeld actine) geïncubeerd met nanodeeltjes RAW 264,7 cellen (niet gelabeld actine) geïncubeerd met Salmonella, actine alleen gelabelde RAW 264,7 cellen.
- Voor de remmer studies is belangrijk om het voertuig controle waarbij de remmer werd opgelost als controle. In dit experiment werd cytochalasine-D opgelost in 100% DMSO. Wij dus, bebroede cellen in cDMEM bevatten DMSO, en daarna de internalisering van nanodeeltjes of Salmonella. We tonen geen significant verschil tussen de medium groep en DMSO controle (gegevens niet getoond).
- De sample voorbereiding handleiding beschikbaar op de Amnis website ( https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf ) is een goede bron voor het controleren van de compatibiliteit van fluoroforen met de ImageStream X. Om dit document te openen, moeten gebruikers eerst (vrij-of-charge) registreert bij Amis.
5. Afnemen van het monster op de ImageStream X
- Power-up ImageStream X en start INSPIRE.
- Initialiseren vloeistofcomponenten. Aan het eind van dit script SpeedBeads moet worden uitgevoerd.
- In het menu Bestand, kies Load Default Template.
- In het foto-album menu Beeld de optie ALL en Druk op Run Setup om beeldvorming van de kralen te starten.
- Stel Core Tracking tot het centrum beelden lateraal (indien nodig).
- Selecteer de Helderveld (BF) kanaal en klik op Stel de intensiteit.
- Wacht tot de stroomsnelheid CV is consequent less dan 0,2%.
- Dagelijks kalibreren van het instrument. In de ASSIST-tabblad, klikt u op Start om kalibraties en testen uit te voeren en te controleren of alle zijn verstreken.
- Druk op Flush Lock and Load (FLL) naar het eerste monster te laden. Laad de helderste monster in het experiment dat fluoresceert bij elke fluorochroom gebruikt. Het is belangrijk dat u dit monster de eerste keer opstart om het instrument instellingen vast te stellen en dan NIET te veranderen voor het gehele experiment.
- Zet op elke laser gebruikt in het experiment en zet het laservermogen zodat elke fluorochroom heeft max pixelwaarden tussen 100 en 4000 telt, zoals gemeten in de scatter plots.
- Stel Cell Indelingscriteria, om de verzameling van ongewenste objecten te verwijderen. Voor het verzamelen van gegevens van alleen de cellen, selecteert u de omgeving ondergrens in BF kanaal tot 50 um. Voorwerpen met kleiner dan 50 pm worden beschouwd vuil en worden niet verkregen. Selecteer de zenders die worden verzameld.
- Voer de bestandsnaam, doelmap, stelt Sequence# Op 1 en het aantal evenementen te verwerven.
- Klik op Uitvoeren Acquire te verzamelen en op te slaan van de eerste experiment gegevensbestand.
- Klik op de FLL en voer de volgende experimentele monster. Herhaal dit tot alle experimentele monsters zijn verzameld.
- Klik op Comp-instellingen (wordt uitgeschakeld helderveld en scatter laser en maakt verzameling van alle kanalen) en het verzamelen van 500 positieve cellen van elke afzonderlijke in lood monster per fluorofoor in het experiment om een schadevergoeding matrix te ontwikkelen.
Samenvattend kan monsters worden uitgevoerd in de volgende volgorde:
- Brightest monster eerst.
- Resterende proefmonsters.
- Compensatie regelt met een kleur fluorescentie.
Tips & Opmerkingen:
- Een INSPIRE sjabloon kan worden opgeslagen en opnieuw geladen om het instrument in te stellen. Als sjablonen worden opgeslagen, kan de autosampler worden gebruikt voor het zonder toezicht operatie om de experimentele monsters lopen met een sjabloon en de compensation controleert met een sjabloon voor elke afzonderlijke kleur controle.
- De ImageStream X-configuratie voor deze experimenten: 488 en 658 nm excitatie lasers; 785 nm scatter laser; 40X (0,75 NA) doelstelling, 6-kanaals systeem met een standaard filter ISX stack. De autosampler optie werd gebruikt om zonder toezicht overname van de monsters mogelijk te maken.
- De volgende instellingen werden voor het experiment gebruikt. Nanodeeltjes zijn afgebeeld met de 488 nm laser ingesteld op 10mW, de 658 nm laser op 50 mW, de 785 nm laser ingesteld op 2 mW en BF in kanaal 1. Salmonella geïnfecteerde cellen werden afgebeeld met de 488 nm laser ingesteld op 20 mW, 658 nm laser op 50 mW, de 785 nm laser ingesteld op 2 mW, en BF in kanaal 1. Compensatie controles werden verzameld in afwezigheid van BF en 785. Ten minste 5000 gebeurtenissen (dus) werden afgebeeld voor elk van de monsters.
6. Image Analysis
- Ideeën te lanceren en dubbelklik op de internalisatie-wizard en de belasting ope van het monster. Rif-bestanden.
- Maak een vergoeding matrix door te klikken op 'Nieuwe Matrix' in stap 2. De vergoeding assistent wordt gestart. Voeg bestanden voor de enkele kleur controles in het experiment. Klik op Volgende in de wizard volgen richtingen totdat de vergoeding matrix bestand wordt opgeslagen en geladen in de box in stap 2 van de internalisering wizard.
- Klik op Volgende en volg de borden tot een. Daf bestand wordt gegenereerd.
- Stel beeldweergave eigenschappen door het selecteren van het beeld kanalen gebruikt tijdens de overname. Klik op de Ch 2 (FITC) en Ch 5 (AF 660). (BF en SSC zijn standaard geselecteerd).
- Selecteer de afbeelding kanaal voor het maken van de cel grens (CH01) en het kanaal waarin nanodeeltjes of bacteriën werden verzameld (CH02).
- Een spreidingsdiagram van Helderveld omgeving versus Helderveld Aspect Ratio van alle van de cellen wordt gegenereerd. Definieer de cel bevolking door te klikken op afzonderlijke punten en gating rond singlets. Enkele cellen een aspect ratio vanronde 1 en wambuizen rond 0,5 (figuur 1a).
- Een histogram van de Helderveld Gradient Root Mean Square (RMS) van de helderveld beeld wordt gegenereerd en de bevolking uitzicht in de fotogalerij is ingesteld op geselecteerde bin (Figuur 1B). Klik op de bakken om te bepalen waar de cellen in de beste aandacht te beginnen en trek een lijn regio poort gericht cellen. Hoe hoger de Gradient RMS, hoe beter geconcentreerd. Sla de volgende stap, tenzij er andere vlekken u wilt poort op.
- Een nieuwe spreidingsdiagram intensiteit van kanaal 2 op de x-as ten opzichte Max Pixel CH2 op de y-as wordt opgewekt (figuur 1c). Klik op de stippen en bekijk de afbeeldingen die u helpen de regio te trekken rond de cellen die positief zijn voor nanodeeltjes of bacteriën.
- Een histogram van de internalisatie functie gegenereerd met een gebied dat begint bij 0, aan te passen door het observeren beelden (figuur 1D). De Internalisatie functie is de verhouding van deintensiteit in de cel om de intensiteit van de gehele cel. Het wordt geschaald dat op een waarde van 0 ongeveer de helft van de intensiteit binnen is. De wizard heeft een gebied aan de binnenkant aan te wijzen door het maken van een masker dat de cel beeld ingang gebruikt van stap 5 naar het celoppervlak te vinden en uitgehold dit met 4 pixels. Merk op dat dit masker handmatig worden aangepast voor verschillende celtypes indien nodig. In dit experiment hebben we handmatig ingesteld de functie door het creëren van een object masker op de helderveld afbeelding eerst en uitgehold dit met 4 pixels. De Internalisatie functie werd vervolgens berekend op basis van dit 4 pixel geërodeerde Object masker. Deze functie stelt ons in staat om onderscheid te maken geïnternaliseerde deeltjes en bacteriën, die de meerderheid van hun fluorescentie-signaal binnen het masker grens te hebben, van het oppervlak gebonden deeltjes en bacteriën, die de meerderheid van hun fluorescentie-signaal buiten het masker grens (figuur 2) hebben.
- Maak een nieuwe histogram met de nieuwe Internalisatie FEAtuur op basis van de geërodeerde Object masker. Teken een regio om poort op geïnternaliseerde cellen door het bekijken van de beelden in geselecteerde bin-modus. In onze experimenten, zetten we deze poort op 0,3. Cellen met een score lager dan 0,3 werden beschouwd als het oppervlak gebonden deeltje positieve cellen.
- Tot slot, om de cellen met achtergrond etikettering op te heffen en specifieke geïnternaliseerde nanodeeltjes of bacteriën te identificeren, werd het IDEAS Spot graaf functie gebruikt. Spot telling is een functie die het aantal aangesloten componenten of kleine maskers in een afbeelding telt. Het masker functies, Spot, Peak en Intensity werden gebruikt om de vlekken te definiëren. De plek masker vindt de heldere details in een beeld dat een gebruiker gespecificeerde straal en drempel waarboven de lokale achtergrond hebben, het masker wordt verfijnd door breken hoge intensiteiten in de individuele plekken met behulp van de Peak-functie en dan plekken boven een intensiteit van 200 tellingen werden opgenomen . Zie de Amnis plek maskeren gids voor meer informatie (figuur 1E). Een statistieken re poort template is gemaakt door het opnemen van verschillende functies in het menu Rapporten.
- Dit bestand is opgeslagen als sjabloon te gebruiken voor batch-analyse van alle experimentele bestanden.
- In de ideeën-software, klikt u op Extra → Batch Gegevensbestanden en input van alle. Rif-bestanden. Voeg de vergoeding matrix-bestand (. CTM) en de template-bestand (. Ast) in de desbetreffende hoofdstukken. Stuur de partij voor verwerking. Na de verwerking stap worden alle. Rif bestanden geanalyseerd en. Daf bestanden worden voor elk van de ruwe bestanden. Een eindverslag bestand wordt gegenereerd met statistieken voor alle monsters.
Tips & Opmerkingen:
- Afbeelding analyse werd uitgevoerd met behulp van het IDEAS-software versie 4.0 en de internalisering tovenaar met enkele wijzigingen. De wizard is zelf-leerzaam en de ouptput. Daf-bestand kan worden gegenereerd door het volgen van de instructies van de wizard.
7. Representatieve resultaten
"> De vertegenwoordiger beelden in figuur 2 blijkt dat MIFC kan worden succes onderscheiden geïnternaliseerde (links) versus oppervlak gebonden (rechtsboven) NP (Figuur 2A) en Salmonella (Figuur 2B). Internalizatie van NF en Salmonella werden verminderd zowel remmende actine en verlagen van de temperatuur tot 4 ° C (Figuur 3A). Het percentage van cellen positief gebonden oppervlak NP verhoogd van ongeveer 8% bij 37 ° C tot meer dan 35% na een cytochalasine-D of 4 ° C behandeling ( fig. 3B). daarentegen het percentage cellen oppervlak gebonden Salmonella teruggebracht van 35% tot 15% na cytochalasine-D behandeling. Incubatie van RAW 264,7 cellen met Salmonella bij 4 ° C daalde internalisatie zonder duidelijke toename van de hoeveelheid oppervlak gebonden bacteriën ten opzichte van de 37 ° C samen controle. deze gegevens blijkt dat <em> Salmonella en NP worden geïnternaliseerd door een soortgelijke cellulaire proces dat actine nodig heeft en is afhankelijk van de temperatuur. Bovendien zijn de gegevens blijkt dat duurzame bevestiging van Salmonella tot macrofagen vereist actine polymerisatie.
Figuur 1. Schematische weergave van de poortschakeling strategie gebruikt om te bepalen geïnternaliseerd versus oppervlak gebonden nanodeeltjes en Salmonella. (A) de analyse te beperken tot enkele cellen, is het belangrijk te elimineren vuil en multi-cellulaire gebeurtenissen. Single cellen en wambuizen werden gescheiden van meercellige aggregaten behulp van de ideeën functies gebied en aspect ratio van de helderveld beeld (M01). Gebied is de grootte van de afbeelding in vierkante micron en beeldverhouding de nevenas gedeeld door de hoofdas en dus een maat voor circulaire (perfecte cirkel een verhouding van 1 hebben; doubletten meestal Aspect ratio's van rond de 0,5 en meercellige aggregaten zijn meestal lager dan 0,5). Een regio is gevestigd op poort op enkele cel evenementen (Stap 6.6). (B) poort aan cellen in-focus, de ideeën zijn voorzien van Gradient RMS van de helderveld beeld wordt uitgezet in een histogram. De Gradient RMS-functie meet de scherpte kwaliteit van een afbeelding door het detecteren van veranderingen van pixelwaarden in het beeld. Een hogere Gradient RMS-waarde geeft een scherp beeld (stap 6.7). (C) groene fluorescentie positieve cellen werden geselecteerd door gating de cellen met hoge Max pixelwaarden en intensiteit van de groene fluorescentie kanaal (stap 6.8). (D) cellen met geïnternaliseerde NP of Salmonella geselecteerd door het kiezen van de celpopulatie een internalisatie score gelijk aan of groter dan 0,3. Cellen die een score minder dan 0,3 werden beschouwd als het oppervlak gebonden (Stap 6.9). (E) cellen in de "geïnternaliseerde" gate werden verder gekarakteriseerd gebaseerd op het aantal vlekken (NP of STM) omdat there waren enkele cellen met achtergrondkleuring die werden geteld als geïnternaliseerde, maar had een plekje waarde van nul (Stap 6.11). Representatieve beelden worden gepresenteerd voor elke poort. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Cell beelden van geïnternaliseerde en oppervlakte gebonden nanodeeltjes (NP) of Salmonella. (A) Afbeeldingen slechts ter illustratie van RAW 264.7 cellen die geïnternaliseerde NP (linker paneel) en cellen waaraan NP zijn gebonden aan hun oppervlak, maar niet geïnternaliseerde (rechter paneel). (B) Afbeeldingen slechts ter illustratie van RAW 264.7 cellen die geïnternaliseerde Salmonella (linker paneel) en cellen waarin Salmonella waren gebonden aan hun oppervlak, maar niet geïnternaliseerde (rechter paneel).
Figuur 3. Cytochalazonde-D behandeling van cellen geremd internalisatie van NF en Salmonella. (A) Voorbehandeling van RAW 264.7 cellen met cytochalasine-D of incubatie bij 4 ° C de incidentie van NP of Salmonella internalisatie ten opzichte RAW 264,7 cellen geïncubeerd bij 37 ° C in medium. RAW 264,7 cellen geïncubeerd in medium met DMSO (bijvoorbeeld mediumcontrole) gelijk internalisatie niveaus NP en Salmonella heeft dan medium alleen (gegevens niet getoond). (B) Voorbehandeling van RAW 264.7 cellen met cytochalasine-D steeg het percentage cellen met een oppervlakte NP gebonden terwijl het verminderen van het percentage cellen met het oppervlak gebonden Salmonella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoek heeft aangetoond dat biologisch afbreekbare nanodeeltjes gebaseerd op poly (melkzuur-co-glycolzuur (PLGA) of polyanhydriden kan worden ingekapselde antigenen of geneesmiddelen leveren doelcellen. Opname van deze nanodeeltjes van fagocyten belangrijk voor de effectiviteit, waardoor kwantitatieve . analyse van de internalisatie van cruciaal belang in het ontwerpen van nieuwe nanodeeltjes systemen Door gebruik te maken van deze methode kan differentiële opname van nanodeeltjes door verschillende celtypen worden geanalyseerd met gemak Tot op heden zijn de conventionele microscopie en flowcytometrie zijn gebruikt voor het kwantificeren van deeltje opname;. maar hun respectieve beperkingen met een hoge doorvoersnelheid en resolutie roep om alternatieve benaderingen van internalisatie te bestuderen. In dit artikel voeren wij MIFC analyse te karakteriseren en te vergelijken hoe het biologische proces van fagocytose verschilt tussen twee soorten doelen-een bacteriële ziekteverwekker en synthetische nanodeeltjes.
De MIFC phagocytoswordt assay gebruikt om verschillen in het mechanisme achter de opname van Salmonella opzichte nanodeeltjes bakenen. Opgemerkt dat remmers kunnen cytotoxische afhankelijk van de incubatietijd en concentratie dus vooraf cytotoxiciteit profilering (bijvoorbeeld belichtingstijd en concentratie) vereist is voor het gebruik 13,14. Afhankelijk van de chemische samenstelling, nanodeeltjes een glasovergangstemperatuur (Tg = 13 ° C) onder RB derhalve vormen aggregaten bij kamertemperatuur 15. Om de aggregatie overwinnen we gesoniceerd de deeltjes en hield ze op ijs vóór toevoeging aan de celculturen. Kinetische studie van nanodeeltjes opname belangrijke informatie over de doelmatigheid van deze deeltjes om de ingekapselde lading te leveren aan antigeen presenterende cellen. Er moet worden genomen om cellen op ijs houden na een bepaald tijdstip verder remmen cellulaire processen. Daartoe hebben we opgemerkt variabiliteit in cellular de opname wanneer de cellen niet werden geplaatst op het ijs. Een beperking van de hierboven beschreven werkwijze is dat het experiment wordt uitgevoerd op hechtende cellen die nodig schrapen technieken om de fagocyten oogsten. Deze procedure kan leiden tot celdood, om zo voor een fout in de data-analyse. De procedure wordt beschreven hierin kunnen ook worden uitgevoerd met cellen in suspensie groeien.
De incubatie van macrofagen met reactieve kleurstoffen of immunokleuring reagentia werd geoptimaliseerd door de hoeveelheid van de resterende buffer aanwezig is volgende fixatie. De aanwezigheid van residuele buffer wordt een verdunningseffect en kan produceren monster monster variatie tussen de verschillende monsters, hetgeen resulteert in strijd gemiddelde fluorescentie-intensiteit waarden. Voorbeeld concentratie (dwz cellen / ml) is ook een belangrijke factor om te overwegen tijdens de overname stap, zoals verdunde monsters resulteren in een langere doorlooptijden. Voor een multi-parametrische vergelijking tussen de verschillendeexperimentele voorbeelden, is het belangrijk om de laserintensiteit constant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sherree L. vriend is in dienst van Amnis Corporation, die de ImageStream X-systeem produceert.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) en het Amerikaanse leger Medical Research en Materieel Command (Grant Numeri W81XWH-09-1 tot 0386 en W81XWH-10-1-0806) bedanken voor de financiële ondersteunen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| 24-well plate | Techno Plastic Products | 92024 | |
| Cell culture Flasks | Techno Plastic Products | 90151 | |
| Cell scraper | Techno Plastic Products | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Technologies | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma-Aldrich | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
References
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
- Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
- Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
- Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
- Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
- Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
- Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
