Summary
I den här artikeln beskriver vi en metod som utnyttjar multispektralt metri avbildning flöde till kvantifiera internalisering av polyanhydrid nanopartiklar eller bakterier från RAW 264.7 celler.
Abstract
Nanopartikulära system har visat sig vara värdefulla verktyg i vaccinet levereras genom sin förmåga att effektivt leverera gods, inklusive proteiner, till antigenpresenterande celler 1-5. Internalisering av nanopartiklar (NP) av antigenpresenterande celler är ett kritiskt steg vid generering av en effektiv immunrespons till det inkapslade antigenet. För att bestämma hur förändringar i nanopartikelformulering påverkan funktion, försökte vi utveckla en hög genomströmning, kvantitativ experimentell protokoll som var förenligt med att upptäcka internaliserade nanopartiklar samt bakterier. Hittills har två oberoende tekniker, mikroskopi och flödescytometri, varit de metoder som används för att studera fagocytos av nanopartiklar. Den höga genomströmningen natur flödescytometri genererar tillförlitliga statistiska uppgifter. På grund av låg upplösning, inte att exakt kvantifiera internaliserat kontra cellbundna nanopartiklar. Mikroskopi genererar bilder med hög rumslig upplösning, however, det är tidskrävande och innebär små urvalsstorlekar 6-8. Multispektralt imaging flödescytometri (MIFC) är en ny teknik som inbegriper aspekter av både mikroskopi och flödescytometri som utför flera färger spektral fluorescens och ljusa fältet avbildning samtidigt genom ett laminärt kärna. Denna funktion ger en korrekt analys av fluorescerande signal intensiteter och rumsliga relationer mellan olika strukturer och cellulära funktioner vid hög hastighet.
Häri beskriver vi en metod som utnyttjar MIFC att karakterisera cellpopulationer som internaliserade polyanhydrid nanopartiklar eller Salmonella enterica serovar Typhimurium. Vi beskriver också beredningen av nanopartiklar suspensioner, cell märkning, förvärv på en ImageStream X-system och analys av data med hjälp av IDÉER ansökan. Vi visar också att tillämpningen av en teknik som kan användas för att differentiera internalisering pathways för nanopartiklar och bakterier genom användning av cytokalasin-D som en inhibitor av aktin-medierad fagocytos.
Protocol
1. RAW 264,7 Cellodling
- Harvest RAW 264.7 celler från sina flaskor när de når sammanflytning genom att skrapa dem försiktigt med en cell skrapa. Count och plattan dem i en 24-brunnars cellodlingsskål med en täthet av 5 x 10 5 celler / brunn i 0,5 ml komplett Dulbeccos Modified Eagle Medium (cDMEM; 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 2 mM GlutaMax, och 10 mM HEPES) och inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
2. Patogena Salmonella enterica Serovar Typhimurium 14.028 Transformation och kultur
- Införa rekombinanta plasmider som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) till S. Typhimurium genom elektroporation. Första, upprätta kultur av Salmonella enterica serovar typhimurium (ATCC 14028) i LB-buljong och inkuberas över natten vid 37 ° C med luftning.
- Nästa dag pelleten 1 ml bakterier vid maximal hastighet i en mikrocentrifug. Tvätta cellerna foåra gånger med 1 ml kall MOPS / glycerol-lösning (1 mM 3 - (N-morfolino) propansulfonsyra (MOPS)-buffert i 20% glycerol) genom att försiktigt resuspendering av pelleten med en pipett mellan varje tvättning 9. Efter den slutliga tvätten, resuspendera pelleten i 50 | il av MOPS / glycerol i vilken ~~~V~~HEAD=NNS 0,5 pg av pAKgfp1 eller pAKgfplux1 plasmid-DNA har tillsatts 10.
- Överför cellsuspensionen till en i förväg kylda 1 mm gap elektroporation kyvett och elektroporera med inställningarna: 1800 V, 200 W, 25 MF. Omedelbart efter pulsen leverans, tillsätt 1 ml LB-buljong och överföra cellsuspensionen till en ny 15 ml-rör. Tillåta cellerna att återhämta sig vid 37 ° C med luftning. Efter en timme, koncentrera cellerna genom centrifugering och resuspendera i ~ 100 | il av återstående supernatanten.
- Slutligen plattan cellerna på LB-plattor innehållande 100 | ig / ml ampicillin och inkuberas över natten vid 37 ° C. Enstaka kolonier renas genom omstrykning med antibiotika urval och uttryck av GFP iar bekräftades genom belysning med en vanlig fluoresceinisotiocyanat (FITC) filteruppsättning.
- Ympa 10 ml LB-buljong innehållande 25 pg / ml ampicillin (eller lämpligt antibiotikum) med en full ögla av Salmonella som har transformerats för att stabilt uttrycker GFP.
- Odla bakterier över natten vid 37 ° C.
- Späd 1:10 Salmonella i en färsk kultur-rör innehållande 10 ml LB kompletterat med ampicillin och inkubera under 5 h vid 37 ° C.
- Mät absorbansen hos kulturen vid 600 nm och beräkna koncentrationen av Salmonella per ml med användning av en tidigare fastställa tillväxtkurva.
- Späda ut Salmonella i cDMEM (0,5 ml / brunn) för att erhålla en multiplicitet av infektion (MOI) av 100 per RAW 264,7 celler.
3. Framställning av nanopartikelsuspension
- Tillverka en procent FITC-laddade nanopartiklar som beskrivits tidigare 11. I korthet partiklar tillverkas genom polyanhydridanti-lösningsmedlet nanoencapsulation, i vilken polymeren löses i metylenklorid (4 ° C vid en koncentration av 25 mg / ml) och utfälldes i pentan (-30 ° C vid ett förhållande 1:200 metylenklorid: pentan). Återhämta nanopartiklar genom vakuumfiltrering. Efter avdunstning av eventuellt kvarvarande lösningsmedel, väga det torkade polyanhydriden nanopartiklar med steriliserad väger papper.
- Tillsätt 5 mg av nanopartiklar till 0,5 ml kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS, kalcium-och magnesiumfri, pH 7,4) i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och hålla den på is tills de nanopartiklar sätts till RAW 264.7-celler.
- Sonikera för nanopartikelsuspension (samtidigt på is) med användning av en ultraljuds-vätska processorn förses med en mikrospets under ca 25 s vid 4 till 6 joule.
4. Fagocytos Analys
- Förbehandla en delmängd av RAW 264.7-celler med 5 ^ g / ml cytokalasin-D 1 timme före införande av NP och Salmonella genom att aspirera mediet och replHANTERA med färsk cDMEM kompletterat med inhibitorn. Återgå kulturerna till 37 ° C inkubator.
- Efter 1 h inkubation med inhibitorn, avlägsna plattorna från inkubatorn, virvel nanopartikeln suspensionen, och tillsätt 10 | il till de lämpliga brunnarna.
- Virvel i Salmonella och infektera RAW 264.7-celler med en MOI av 100 genom att lägga de bakterier till de lämpliga brunnarna.
- Knacka plattan få gånger för att blanda och inkubera vid 37 ° C eller 4 ° C (kontroll) under 45 min.
- Ta bort plattorna från inkubatorn eller kylskåpet och placera på is. Tvätta cellerna två gånger med iskall PBS (utan Ca 2 + och Mg 2 +) genom att aspirera och förkasta den gamla mediet för att avlägsna obundna partiklar, Salmonella, och döda eller lösgjorda RAW 264.7-celler.
- Att skörda RAW 264.7 celler efter den andra tvätten, tillsätt 250 | il iskall PBS och försiktigt skrapa brunnarna.
- Pipettera de skördade cellerna i klar uppfattning snäpplock microcentrifugrör och hålla dem på is.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 1 ml kall tvättbuffert (2% värmeinaktiverat FBS, 0,1% natriumazid i PBS) och centrifugera vid 250 x g under 10 min vid 4 ° C.
- Kasta bort supernatanten och avlägsna kvarvarande buffert genom att trycka den inverterade mikrocentrifugrör på pappershandduk. Resuspendera cellpelleten genom att försiktigt skrapa mikrocentrifugrör över en provrörsställ.
- Fixera RAW 264.7-celler genom tillsats av 100 pl av 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS och tillåta cellerna att stå under 15 min vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta RAW 264.7-celler genom tillsats av 1 ml av Perm / tvättbuffert (BD Biosciences) och centrifugera vid 250 x g under 10 min vid 4 ° C.
- Upprepa steg 4,9.
- Färga RAW 264.7-celler för aktin genom att tillsätta 100 pl av Perm / tvättbuffert innehållande Alexa Fluor falloidin 660 (AF 660; 1:150 spädning) i 15 min vid rumstemperatur. Upprepa steg 4.11 och 4,12.
- Resuspendera RAW 264.7-celler i 50 | ilPBS innehållande 1% PFA och lagra dem i mörker vid 4 ° C tills förvärvet.
Tips och anteckningar:
- Enfärgade fluorescens prover bör beredas i detta steg för att användas som ersättning kontroller medan du ställer in ImageStream X instrumentet. Ersättningen kontrollerar ingår i detta experiment var: RAW 264.7 celler (som inte är märkt för aktin) inkuberas med nanopartiklar, RAW 264.7 celler (som inte är märkt för aktin) inkuberas med Salmonella, aktin enbart märkta RAW 264.7 celler.
- För inhibitorn studier är det viktigt att ta med vehikelkontroll, i vilken inhibitorn löstes som en kontroll. I detta experiment var cytokalasin-D upplöstes i 100% DMSO. Vi är därför inkuberade celler i cDMEM innehåller DMSO och sedan utvärderas internalisering av nanopartiklar eller Salmonella. Vi har inte upptäcka någon signifikant skillnad mellan mediet gruppen och DMSO kontroll (data visas ej).
- Sa-mple förberedelseguide finns på Amnis webbplats ( https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf ) är en bra resurs för att kontrollera förenlighet fluoroforer med ImageStream X. För att komma åt detta dokument, måste användarna först registrera (fri-of-avgift) med Amis.
5. Provtagning på ImageStream X
- Power up ImageStream X och lansering Inspire.
- Initiera Fluidics. I slutet av det här skriptet SpeedBeads ska köras.
- I filen, välj Lägg i standardmall.
- I Bildgalleri Visa-menyn, välj alla och tryck Kör Setup för att starta avbildning pärlorna.
- Justera Kärna Tracking till centrum bilder lateralt (vid behov).
- Välj Brightfield (BF) kanalen och klicka på Ange intensitet.
- Vänta tills flödeshastigheten CV är genomgående less än 0,2%.
- Kalibrera instrumentet dagligen. I ASSIST fliken Start Alla att köra kalibreringar och tester och kontrollera att alla har gått.
- Tryck Flush Lock och Load (FLL) för att ladda det första provet. Ladda den ljusaste provet i experiment som fluorescerar med varje fluorokrom som används. Det är viktigt att du kör detta prov först med att etablera instrumentets inställningar och sedan inte ändra dem för hela experimentet.
- Slå på varje laser som används i försöket och ställ Laser Ström så att varje fluorokrom har max pixelvärden mellan 100 och 4000 räknas, mätt i spridningsdiagram.
- Fastställa kriterier Cell Klassificering, för att eliminera samling oönskade objekt. För insamling av uppgifter från endast de celler markerar du området undre gränsen i BF-kanalen till 50 nm. Föremål med ytor mindre än 50 pm kommer att betraktas skräp och kommer inte förvärvas. Välj kanaler som ska samlas in.
- Skriv in filnamnet, Destination Folder, ställ Sequence# Till 1 och antalet händelser att förvärva.
- Klicka på Kör Skaffa att samla och spara det första experimentet datafilen.
- Klicka FLL och kör nästa experimentella provet. Upprepa tills alla experimentella prover har samlats in.
- Klicka på Comp Inställningar (stängs av brightfield och strö laser och möjliggör insamling av alla kanaler) och samla 500 positiva celler från varje enskild färgade provet för varje fluorofor i experimentet att utveckla en ersättning matris.
För att sammanfatta, kan prover köras i följande ordning:
- Ljusaste provet först.
- Återstående proverna.
- Ersättning styr innehållande enda färg fluorescens.
Tips och anteckningar:
- En Inspire mall kan sparas och laddas för att ställa in instrumentinställningar. När mallar sparas, kan autosampler användas för obevakad drift för att köra experimentella prov med en mall och compensation styr med en mall för varje enskild färg kontroll.
- Den ImageStream X-konfiguration för dessa experiment: 488 och 658 nm excitation lasrar, 785 nm skingra laser, 40X (0,75 NA) Mål, 6 kanals system med en vanlig ISX filter stack. Den autosampler alternativet används för att tillåta obevakad förvärvet av proverna.
- Följande inställningar användes för experimentet. Nanopartiklar har avbildades med 488 nm laser satt till 10 mW, ställa in 658 nm lasern till 50 mW, ställa in 785 nm laser för att 2 mW och BF i kanal 1. Var avbildades med 488 nm lasern inställd på 20 mW Salmonella infekterade celler, 658 nm laser inställd på 50 mW, ställa in 785 nm lasern till 2 MW, och BF i kanal 1. Kompensation kontroller uppsamlades i frånvaro av BF och 785. Minst 5000 händelser (dvs celler) avbildades för varje test-proven.
6. Bildanalys
- Starta Idéer och dubbelklicka på internalisering guiden och belastning påe av testprovet. Rif filer.
- Skapa en ersättning matris genom att klicka på "Ny Matrix" i steg 2. Ersättningen Guiden lanseras. Lägg till filer för ensamstående färg kontrollerna i experimentet. Klicka på Nästa i guiden efter riktningar tills ersättningen matrisen filen sparas och laddas i lådan i steg 2 i internalisering guiden.
- Klicka på Nästa och följ anvisningarna tills en. Daf-fil genereras.
- Ange egenskaper för bildvisning genom att välja bilden kanaler som används vid förvärvet. Klicka på CH 2 (FITC) och Ch 5 (AF 660). (BF och SSC är standard vald).
- Välja bilden kanal för att göra cellgränsen (Ch01) och kanalen i vilken nanopartiklar eller bakterier uppsamlades (CH02).
- En punktdiagram av Brightfield området kontra Brightfield Proportioner av alla celler alstras. Definiera en enda cell befolkningen genom att klicka på enskilda punkter och styrande runt undertröjor. Enstaka celler har ett sidförhållande av ettomgång 1 och dubbletter runt 0,5 (Figur 1A).
- Ett histogram av Brightfield Gradient Root Mean Square (RMS) i brightfield bilden genereras och befolkningen vyn i bildgalleriet är inställd till vald bin (Figur 1B). Klicka på lådorna för att avgöra var celler i bästa fokus börja och dra en linje region gate fokuserade celler. Ju högre övertoningsverktyget RMS, desto bättre fokuserad. Hoppa över nästa steg om det inte finns andra fläckar som du vill gate på.
- En ny spridningsdiagram av intensitet i Kanal 2 på x-axeln mot Max pixel Ch2 på y-axeln genereras (Figur 1C). Klicka på prickarna och visa bilder som hjälper dig dra regionen runt de celler som är positiva för nanopartiklar eller bakterier.
- Ett histogram över internalisering funktionen genereras med ett område som börjar vid 0, som bör anpassas genom att observera bilder (figur 1D). Internalisering funktion är ett förhållande avintensitet inuti cellen till intensiteten av den hela cellen. Det skalas så att vid ett värde av 0 ungefär hälften av intensiteten är inom. Guiden har skapat ett område för att beteckna insidan genom att göra en mask som har använt indatacell bilden från steg 5 för att hitta cellytan och eroderas detta genom 4 pixlar. Notera att denna mask manuellt kan justeras för olika celltyper vid behov. I detta experiment, justerat vi manuellt funktionen genom att skapa ett objekt mask på brightfield bilden först och eroderas detta genom 4 pixlar. Internalisering Funktionen sedan beräknats baserat på detta 4 pixel eroderade Object mask. Denna funktion gör det möjligt för oss att skilja internaliserade partiklar och bakterier, som har huvuddelen av sina fluorescenssignal inom masken gränsen, från ytbunden partiklar och bakterier, som har huvuddelen av sina fluorescenssignal utanför masken gränsen (Figur 2).
- Skapa ett nytt histogram med den nya Internalization feaTure baserat på den eroderade Objekt masken. Rita en region porten på internaliserade celler genom att titta på bilder i den valda bin läge. I våra experiment satte vi denna grind på 0,3. Celler med en poäng lägre än 0,3 ansågs ytbundna partikel-positiva celler.
- Slutligen, för att eliminera cellerna med bakgrund märkning och för att identifiera specifika internaliserade nanopartiklar eller bakterier, var IDÉER Spot greven funktionen används. Spot räkna är en funktion som räknar antalet anslutna komponenter eller små masker i en bild. De maskfunktioner, Spot, Peak och intensitet används för att definiera fläckar. Platsen Masken hittar de ljusa detaljerna i bilden som har en specificerad radie och tröskel över den lokala bakgrunden är masken förfinas genom att bryta isär höga nivåer i enskilda punkter med hjälp av Peak funktionen och sedan fläckar över en intensitet av 200 räkningar ingick . Se Amnis guiden plats maskering för ytterligare information (Figur 1E). En statistik re port mall genererades genom att inkludera olika funktioner i menyn Rapporter.
- Denna fil sparades som mall fil som skall användas för satsvis analys av samtliga experimentella filer.
- I Idéer programmet, klicka på Verktyg → Batch Datafiler och in alla. Rif-filer. Lägg till filen ersättningen matrisen (. CTM) och mallen filen (. AST) i motsvarande avsnitt. Skicka partiet för bearbetning. Efter behandlingssteget är alla. Rif filer analyseras och. Daf filer genereras för var och en av de individuella råfiler. En slutrapport fil genereras med statistik för alla prover.
Tips och anteckningar:
- Bildanalys utfördes med hjälp Idéer 4,0 programversion och internalisering guiden med vissa modifieringar. Guiden är självinstruerande och ouptput. Daf-fil kan genereras genom att följa instruktionerna i guiden.
7. Representativa resultat
"> De representativa bilder i figur 2 visar att MIFC kan användas för att framgångsrikt skilja mellan internaliserad (vänstra panelen) kontra ytbundet (höger panel) NP (figur 2A) eller Salmonella (figur 2B). Var Internalisering av NP och Salmonella reduceras genom både inhibering aktin och sänkning av temperaturen till 4 ° C (fig 3A). Den procentuella andelen celler som var positiva för bunden yta ökas NP från cirka 8% vid 37 ° C och över 35% efter antingen cytokalasin-D eller 4 ° C behandling ( Fig. 3B). Däremot var andelen celler med ytan bundet Salmonella minskat från 35% till 15% efter cytochalasin-D behandling. Inkubering av RAW 264.7 celler med Salmonella vid 4 ° C minskade internalisering utan att en påtaglig ökning av mängden ytbunden bakterier jämfört med 37 ° C-kontroll. Tillsammans visar dessa data att <em> Salmonella och NP internaliseras genom en liknande cellulär process som kräver aktin och är temperaturberoende. Dessutom data indikerar att hållbar infästning av salmonella att makrofager kräver aktin polymerisation.
Figur 1. Schematisk av gating strategin användas för att bestämma internaliserat kontra ytbunden nanopartiklar och Salmonella. (A) För att begränsa analysen till enskilda celler, är det viktigt att eliminera skräp och multi-cellulära händelser. Enstaka celler och dubbletter skildes från flercelliga aggregat med Idéer funktioner området och bildformat för den brightfield bilden (M01). Area är storleken på bilden i kvadratmikrometer och proportioner är lillaxeln dividerat med huvudaxeln och därför ett mått på cirkularitet (en perfekt cirkel har ett bildförhållande på 1, dubbletter har vanligen Aspect förhållanden av omkring 0,5 och multicellulära aggregat är typiskt mindre än 0,5). En region drogs till porten på enstaka celler händelser (steg 6,6). (B) till gate på celler i fokus, idéerna har Övertoning RMS av brightfield bilden ritas i ett histogram. Övertoning RMS-funktionen mäter skärpan kvaliteten på en bild genom att detektera förändringar i pixelvärden i bilden. Ett högre Gradient RMS värde visar en mer fokuserad bild (steg 6,7). (C) grön fluorescens-positiva celler selekterades genom grindning på cellerna med höga Max pixelvärden och intensitet i grön fluorescens kanal (steg 6.8). (D) Celler med internaliserad NP eller Salmonella selekterades genom att välja den cellpopulation med en internalisering poäng som är lika med eller större än 0,3. Celler som får en poäng mindre än 0,3 ansågs vara ytbundna (steg 6,9). (E) celler i "intern" gate karaktäriserades vidare baserat på antalet fläckar (NP eller STM) eftersom there var några celler med bakgrundsfärgning som räknas som internaliserat men hade en plats värdet noll (steg 6,11). Representativa bilder presenteras för varje port. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Cellbilder av internaliserade och ytan bundna nanopartiklar (NP) eller Salmonella. (A) Representativa bilder av RAW 264.7-celler som internaliseras NP (vänster fält) och celler till vilka NP var bundna till deras yta men inte internaliseras (höger panel). (B) Representativa bilder av RAW 264.7-celler som internaliseras Salmonella (vänster fält) och celler till vilka Salmonella var bundna till deras yta men inte internaliseras (höger panel).
Figur 3. CytochalaSIN-D behandling av celler hämmade internalisering av nonylfenol och Salmonella. (A) Förbehandling av RAW 264.7 celler med cytochalasin-D eller inkubation vid 4 ° C minskade incidensen av NP och Salmonella intemalisering i jämförelse med RAW 264.7-celler som inkuberats vid 37 ° C i medium. RAW 264.7-celler som inkuberats i medium innehållande DMSO (dvs., vehikelkontroll) visade liknande nivåer internaliseringen för NP och Salmonella jämfört med enbart medium (data ej visade). (B) Förbehandling av RAW 264.7-celler med cytokalasin-D ökade procentandelen celler med ytbundna NP samtidigt minska procentandelen celler med ytbundet Salmonella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier har visat att bionedbrytbara nanopartiklarna baserade på poly (mjölksyra-sam-glykolsyra (PLGA) eller polyanhydrider kan användas för att leverera antigener inkapslade eller läkemedel till målceller. Upptag av dessa nanopartiklar av fagocytiska celler är viktig för deras effektivitet, vilket gör kvantitativ . analys av internalisering kritisk vid utformning av nya system nanopartiklar leveranssystem Genom att använda denna metod kan differentiell upptag av nanopartiklar av olika celltyper skall analyseras med lätthet Hittills konventionell mikroskopi och flödescytometri har använts för att kvantifiera partikelupptagning;. emellertid deras respektive begränsningar med hög genomströmning och upplösning kräver alternativa tillvägagångssätt för att studera internalisering. I den här artikeln utför vi MIFC analys för att karakterisera och jämföra hur den biologiska processen av fagocytos skiljer mellan två typer av mål-en bakteriell patogen och syntetiska nanopartiklar.
Den MIFC phagocytosär analysen användes för att beskriva skillnaderna i den mekanism som ligger bakom upptaget av Salmonella i jämförelse med nanopartiklar. Det bör noteras att inhibitorer kan vara cytotoxiska beroende på deras inkubationstid och koncentration, och därför en känd cytotoxicitet profilering (dvs., exponeringstid och koncentration) är nödvändig innan deras användning 13,14. Beroende på deras kemiska sammansättning, kan nanopartiklar har en glastemperatur (Tg = 13 ° C) under RT följaktligen bildar de aggregat vid RT 15. För att övervinna den aggregering, sonikerades vi partiklarna och höll dem på is före tillsats till cellkulturerna. Kinetiska studier av nanopartiklar upptag ger viktig information om effektiviteten hos dessa partiklar att leverera den inkapslade nyttolasten till antigenpresenterande celler. Försiktighet måste vidtas för att hålla cellerna på is vid slutet av en given tidpunkt för att inhibera ytterligare cellulära processer. För detta ändamål har vi noterat variabilitet i cellular upptag när cellerna inte placerades på is. En begränsning hos den ovan beskrivna metoden är att experimentet utförs på adherenta celler, som kräver att skrapa tekniker för att skörda de fagocytiska cellerna. Detta förfarande kan leda till celldöd, vilket införa något fel i dataanalysen. Det förfarande som vi beskriver häri skulle också kunna utföras med användning av celler som växer i suspension.
Inkubering av makrofager med reaktiva färgämnen eller reagens immunomärkning optimerades genom att minska mängden kvarvarande buffert föreliggande efter fixering. Närvaron av kvarvarande buffert skapar en utspädningseffekt och kan producera prov till prov variationen bland de multipla prover, vilket därigenom resulterar i inkonsekventa genomsnittlig fluorescensintensitet värden. Provkoncentration (dvs celler / ml) är också en viktig faktor att beakta under förvärvet steg, som utspädd prov resulterar i längre sikt tider. För en multi-parametrisk jämförelse mellan olikaexperimentella proverna, är det viktigt att hålla laserintensiteten konstant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sherree L. vän är anställd av Amnis Corporation, som tillverkar ImageStream X-system.
Acknowledgments
Författarna vill tacka ONR-Muri Award (NN00014-06-1-1176) och den amerikanska armén medicinsk forskning och Materielverk (Grant Numbers W81XWH-09-1-0386 och W81XWH-10-1-0806) för den finansiella stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| 24-well plate | Techno Plastic Products | 92024 | |
| Cell culture Flasks | Techno Plastic Products | 90151 | |
| Cell scraper | Techno Plastic Products | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Technologies | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma-Aldrich | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
References
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
- Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
- Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
- Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
- Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
- Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
- Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
