Summary
Neste artigo, nós descrevemos um método utilizando multi-espectral citometria de fluxo de imagem para quantificar a internalização de nanopartículas polianidrido ou bactérias por células RAW 264.7.
Abstract
Sistemas nanoparticulados surgiram como instrumentos valiosos na entrega de vacina através da sua capacidade para entregar eficientemente carga, incluindo proteínas, para as células apresentadoras de antigénio 1-5. Internalização de nanopartículas (NP) por células apresentadoras de antigénio é um passo crítico na geração de uma resposta imune eficaz para o antigénio encapsulado. Para determinar como as mudanças em função de nanopartículas impacto formulação, buscou-se desenvolver um alto throughput, protocolo quantitativo experimental que era compatível com a detecção de nanopartículas internalizadas, bem como bactérias. Até à data, duas técnicas independentes, microscopia e citometria de fluxo, têm sido os métodos utilizados para estudar a fagocitose de nanopartículas. A natureza de alto rendimento da citometria de fluxo gera robustos dados estatísticos. No entanto, devido à baixa resolução, ele não consegue quantificar com precisão internalizado contra células nanopartículas encadernados. Microscopia gera imagens com alta resolução espacial; however, é demorado e envolve amostras de pequenas dimensões 6-8. Multi-espectrais de citometria de fluxo de imagem (CFMI) é uma nova tecnologia, que incorpora os aspectos de microscopia e citometria de fluxo que executa várias cores de imagem de campo brilhante e fluorescência espectral simultaneamente através de um núcleo laminar. Este recurso fornece uma análise acurada da intensidade de sinal fluorescentes e as relações espaciais entre as diferentes estruturas e funções celulares em alta velocidade.
Aqui, nós descrevemos um método utilizando CFMI para caracterizar as populações de células que têm internalizado nanopartículas polianidrido ou Salmonella enterica sorovar Typhimurium. Descrevemos também a preparação de suspensões de nanopartículas, de rotulagem celular, aquisição de um sistema X ImageStream e análise dos dados usando o aplicativo IDÉIAS. Nós também demonstrar a aplicação de uma técnica que pode ser utilizado para diferenciar o p internalizaçãoathways para as nanopartículas e bactérias por utilizando citocalasina-D como um inibidor da actina mediada por fagocitose.
Protocol
1. Cultura de Células RAW 264,7
- Colheita células RAW 264.7 de seus frascos quando atingem confluência raspando-as delicadamente com uma espátula de celulares. Contagem e da placa-los em um prato de cultura de 24 poços de células a uma densidade de 5 x 10 5 células / poço em 0,5 mL de Dulbecco Modificado completa Eagle Médium (cDMEM; 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de Glutamax, e 10 mM de HEPES) e incubar durante a noite a 37 ° C em um 5% de CO 2 incubadora.
2. Patogênica Salmonella enterica sorovar Typhimurium 14028 Transformação e Cultura
- Introduzir plasmídeos recombinantes que expressam a proteína verde fluorescente (GFP) para S. Typhimurium por eletroporação. Primeiro, prepara cultura de Salmonella entérica serovar Typhimurium (ATCC 14028) em caldo de LB e incubar durante a noite a 37 ° C com arejamento.
- No dia seguinte, pelete de 1 mL de bactérias a uma velocidade máxima numa microcentrífuga. Lave as células four vezes com 1 mL de MOPS a frio / solução de glicerol (1 mM 3 - (N-morfolino) propanossulfónico tampão (MOPS) em glicerol a 20%) por suavemente ressuspender o sedimento com uma pipeta entre cada lavagem 9. Após a lavagem final, ressuspender o pellet em 50 ul de MOPS / glicerol em que ~~~V~~HEAD=NNS 0,5 ug de pAKgfp1 ou pAKgfplux1 DNA de plasmídeo foi adicionado 10.
- Transferir a suspensão de célula para uma cuvete de 1 milímetro de pré-refrigeradas electroporação lacuna e electroporate usando as definições: 1800 V, 200 W, 25 MF. Imediatamente após a entrega de pulso, adicionar 1 ml de caldo LB e transferir a suspensão de células para um tubo novo mL 15. Permitir que as células para se recuperar a 37 ° C, com arejamento. Após uma hora, concentrar as células por centrifugação e ressuspender em ~ 100 uL de sobrenadante restante.
- Finalmente, a placa de as células em placas de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° C. Colónias únicas são purificados por restreaking com selecção de antibiótico e de expressão da GFP is confirmada por iluminação com um isotiocianato de fluoresceína padrão (FITC) conjunto de filtros.
- Inocular 10 mL de caldo LB contendo 25 ug / ml de ampicilina (ou o antibiótico apropriado) com uma ansa cheia de Salmonella que foi transformado para a GFP expressa de forma estável.
- Crescer as bactérias durante a noite a 37 ° C.
- Diluir 1:10 Salmonella para um tubo de cultura fresco, contendo 10 mL LB suplementado com ampicilina e incubar durante 5 horas a 37 ° C.
- Medir a absorvância da cultura a 600 nm e calcular a concentração do Salmonella por mL utilizando um anteriormente estabelecer curva de crescimento.
- Dilui-se a Salmonella em cDMEM (0,5 mL / poço) para se obter uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 por célula 264,7 RAW.
3. Preparação da suspensão de nanopartículas
- Fabricar 1% de FITC-carregados nanopartículas, como descrito anteriormente 11. Resumidamente, as partículas são fabricados por polianidridoanti-solvente nanoencapsulação, no qual o polímero é dissolvido em cloreto de metileno (4 ° C a uma concentração de 25 mg / mL) e precipitado em pentano (-30 ° C a uma razão de 1:200 cloreto de metileno: pentano). Recuperar nanopartículas por filtração sob vácuo. Depois de evaporar qualquer solvente residual, pesar o polianidrido seca nanopartículas usando esterilizado pesar papel.
- Adicionar 5 mg de nanopartículas de 0,5 mL de fosfato frio salino tamponado (PBS, cálcio e magnésio livre, pH 7,4) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e mantê-lo em gelo até que as nanopartículas são adicionadas às células RAW 264.7.
- Sonicar a suspensão de nanopartículas (mantendo em gelo), utilizando um processador ultra-líquido equipado com um microtip de cerca de 25 s, de 4 a 6 joules.
4. Ensaio de fagocitose
- Pré-tratamento de um subconjunto de células RAW 264.7 com 5 ug / mL citocalasina-D 1 hr antes da introdução de NP ou Salmonella por aspiração médio e replacing com cDMEM fresco suplementado com o inibidor. Retornar as culturas a 37 ° C incubadora.
- Após a incubação de 1 hora com o inibidor, retirar as placas da incubadora, vórtice a suspensão de nanopartículas, e adicionar 10 uL aos poços apropriados.
- Vórtice da Salmonella e infectar as células RAW 264.7 com um MOI de 100 por adição de as bactérias aos poços apropriados.
- Toque os tempos de placas, para misturar e incubar a 37 ° C ou 4 ° C (controlo) durante 45 min.
- Remova as placas da incubadora ou geladeira e colocar no gelo. Lave as células duas vezes com PBS gelado (sem Ca 2 + e Mg 2 +) por aspiração e descartar o meio antigo para remover as partículas não ligadas, Salmonella e mortas ou geminada células RAW 264.7.
- Para a colheita das células RAW 264.7 após a segunda lavagem, adicionar 250 uL de PBS gelado e raspe dos poços.
- Pipetar as células colhidas em vista clara pressão cap microtubos de centrífuga e mantê-los em gelo.
- Lave as células por adição de 1 mL de tampão de lavagem a frio (2% de FBS inactivado calor, azida de sódio a 0,1% em PBS) e centrifugar a 250 X g durante 10 min a 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante e remover o tampão residual tocando o tubo de microcentrífuga de invertida sobre uma toalha de papel. Ressuspender o sedimento de células por suavemente raking o tubo de microcentrífuga através de um suporte de tubos de ensaio.
- Fixar as células RAW 264.7 pela adição de 100 uL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS e permitir que as células em repouso durante 15 min à temperatura ambiente (RT).
- Lave as células RAW 264.7 por adição de 1 mL de Perm / tampão de lavagem (BD Biosciences) e centrifugar a 250 X g durante 10 min a 4 ° C.
- Repita o passo 4.9.
- Corar as células RAW 264.7 de actina por adição de 100 ul de Perm / tampão de lavagem contendo Alexa Fluor faloidina 660 (AF 660; 1:150 de diluição) durante 15 min à TA. Repita os passos 4.11 e 4.12.
- Ressuspender as células RAW 264.7 em 50 uL dePBS contendo 1% de PFA e armazená-los no escuro a 4 ° C até a aquisição.
Dicas e notas:
- As amostras de fluorescência única cor deve ser preparada neste passo a ser utilizados como controlos de compensação enquanto se ajusta o instrumento ImageStream X. A compensação controla incluídos nesta experiência foram de: células RAW 264.7 (não rotulada para a actina) incubadas com nanopartículas; células RAW 264.7 (não rotulada para a actina) incubadas com Salmonella; actina apenas rotulados células RAW 264.7.
- Para os estudos de inibidor, é importante para incluir o controlo de veículo em que o inibidor foi dissolvido como um controlo. Nesta experiência, citocalasina-D foi dissolvido em DMSO a 100%. Nós, portanto, as células incubadas em cDMEM contendo DMSO e em seguida avaliou a internalização de nanopartículas ou Salmonella. Não foi detectada nenhuma diferença significativa entre o grupo de controlo médio e DMSO (dados não mostrados).
- A saguia de preparação mple disponível no site Amnis ( https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf ) é um bom recurso para verificar a compatibilidade dos fluoróforos com o X ImageStream. Para acessar este documento, os usuários devem primeiro se registrar (gratuitamente) com a Amis.
5. Aquisição de amostra no X ImageStream
- Poder-se ImageStream X e lançamento INSPIRE.
- Inicializar Fluidics. No final deste SpeedBeads de script deve ser executado.
- No menu arquivo, escolha Carregar modelo padrão.
- No menu de exibição Galeria de Imagens, selecione tudo e pressione Executar para iniciar a instalação de imagem dos grânulos.
- Ajuste núcleo de controle para imagens centro lateralmente (se necessário).
- Selecione o canal Brightfield (BF) e clique em Set Intensidade.
- Aguarde até que o CV velocidade do fluxo é consistentemente less do que 0,2%.
- Calibrar o aparelho diariamente. Na guia ASSIST, clique em Iniciar Todos executar calibrações e testes e verificar que todos passaram.
- Pressione Bloquear Flush e de carga (FLL) para carregar a primeira amostra. Coloque o mais brilhante exemplo no experimento que fluoresce com cada fluorocromo usado. É fundamental que você executar esse exemplo primeiro a estabelecer os ajustes do instrumento e depois não mudá-los para todo o experimento.
- Ligue cada laser usado no experimento e defina a potência do laser para cada fluorocromo tem valores de pixel máximo entre 100 e 4000 contagens, medidas nos gráficos de dispersão.
- Definir os critérios de classificação da pilha, para eliminar a coleção de objetos indesejados. Para a coleta de dados apenas a partir das células, selecione Limitar a área mais baixa em BF canal para 50 mM. Objectos com área inferior a 50 um serão considerados detritos e não serão adquiridas. Selecione os canais a serem coletados.
- Digite o nome do arquivo, pasta de destino, sequência definida# A 1 eo número de eventos a adquirir.
- Clique em Executar Adquirir para coletar e guardar o primeiro experimento de arquivo de dados.
- Clique FLL e executar a próxima amostra experimental. Repita até que todas as amostras experimentais foram recolhidos.
- Clique em Configurações Comp (desliga-se claro e laser de dispersão e permite a coleta de todos os canais) e coletar 500 células positivas de cada amostra manchado para cada fluoróforo na experiência para desenvolver uma matriz de compensação.
Para resumir, as amostras podem ser executados na seguinte ordem:
- Brightest primeira amostra.
- Restantes amostras de teste.
- Compensação controla contendo fluorescência única cor.
Dicas e notas:
- Um modelo INSPIRE podem ser salvos e recarregados para definir as configurações do aparelho. Uma vez que os modelos são salvos, o amostrador automático pode ser usado para a operação autônoma para executar as amostras experimentais com um modelo e compensation controla com um modelo para cada controle de cor única.
- O ImageStream configuração X para estas experiências: 488 e 658 lasers de excitação nm; 785 nm do laser de dispersão; objetivo (0,75 NA) 40X, 6 sistema de canal com uma pilha ISX padrão do filtro. A opção de amostrador automático foi utilizado para permitir a aquisição automática das amostras.
- As definições seguintes foram usadas para a experiência. As nanopartículas foram fotografadas com o laser de 488 nm definir a 10mW, o laser nm 658 ajustado para 50 mW, o laser de 785 nm definido para 2 mW e BF no canal 1. Células infectadas por Salmonella foram fotografadas com o laser de 488 nm definido para 20 mW, 658 nm do laser ajustado para 50 mW, a 785 nm do laser definido para 2 mW, e BF no canal 1. Controles de compensação foram coletadas na ausência de BF e 785. Pelo menos, 5000 eventos (ie, células) foram fotografadas para cada uma das amostras de teste.
6. Análise de Imagem
- Lançamento IDÉIAS e dê um duplo clique sobre o assistente de Internalização e carga noe da amostra de teste. arquivos Rif.
- Criar uma matriz de compensação, clicando em "Nova Matriz" no passo 2. O assistente de compensação é lançado. Adicionar arquivos para os controles de cor única na experiência. Clique em Avançar através do assistente seguindo as instruções até que o arquivo matriz compensação é salvo e carregado na caixa na etapa 2 do assistente Internalização.
- Clique em Avançar e siga as instruções até que um arquivo. Daf é gerado.
- Definir as propriedades de exibição de imagem, selecionando os canais de imagem usados durante a aquisição. Clique na Ch 2 (FITC) e Ch 5 (AF 660). (BF e SSC são padrão selecionado).
- Seleccionar o canal de imagem para fazer o limite da célula (CH01) e do canal em que as nanopartículas ou bactérias foram recolhidas (CH02).
- Uma dispersão de Brightfield Área contra Brightfield Proporção de todas as células é gerado. Definir a população única célula clicando em pontos individuais e de propagação em torno de singletos. As células individuais têm uma relação de aspecto de umround 1 e doublets cerca de 0,5 (Figura 1A).
- Um histograma da Raiz Gradiente Brightfield Mean Square (RMS) da imagem de campo claro é gerada e a visão da população na galeria de imagens está definido como bin selecionado (Figura 1B). Clique nas caixas para determinar onde as células em melhor foco e começar a desenhar uma região da linha de células portão focados. Quanto maior o gradiente RMS, a melhor focado. Ir a próxima etapa a menos que haja outras manchas que você quer portão.
- Uma dispersão de novo de intensidade de Canal 2 sobre o pixel eixo x contra Max de Ch2 sobre o eixo y é gerado (Figura 1C). Clique sobre os pontos e ver as imagens para ajudar você a chamar a região ao redor das células que são positivos para as nanopartículas ou bactérias.
- Um histograma da característica Internalização é gerado com uma região que começa no 0, o qual deve ser ajustado pela observação de imagens (Figura 1D). A característica Internalização é um rácio entre ointensidade no interior da célula para a intensidade de toda a célula. Ele será dimensionado de tal modo que a um valor de 0 a cerca de metade da intensidade está dentro. O assistente criou uma região para designar o interior através de uma máscara que tem utilizado a célula de entrada de imagem a partir do passo 5 para encontrar a superfície da célula e erosão este por 4 pixels. Note-se que esta máscara pode ser ajustado manualmente para diferentes tipos de células, quando necessário. Neste experimento, foi ajustado manualmente o recurso através da criação de uma máscara de objeto na imagem brightfield primeiro e corroído este por 4 pixels. O recurso de internalização foi então calculado com base nesta 4 máscara objeto de pixel erodido. Esta característica permite distinguir partículas internalizados e bactérias, que têm a maior parte do seu sinal de fluorescência dentro do limite de máscara, a partir de partículas de superfície ligados e bactérias, que têm a maior parte do seu sinal de fluorescência fora do limite da máscara (Figura 2).
- Criar um histograma novo com a interiorização novo featura com base na máscara de objeto erodido. Desenhe uma região para a porta das células internalizados através da visualização das imagens no modo bin selecionado. Em nossos experimentos, vamos definir esta porta a 0,3. As células com uma pontuação inferior a 0,3 foram consideradas células da superfície de partículas ligadas positivos.
- Finalmente, para eliminar as células com a rotulagem de fundo e para identificar específicas internalizados nanopartículas ou bactérias, as ideias característica contagem de manchas foi usado. Contagem de manchas é um recurso que conta o número de componentes conectados ou máscaras pequenas em uma imagem. As funções da máscara, Spot Pico e intensidade foram utilizados para definir os pontos. A máscara de mancha encontra os detalhes brilhantes em uma imagem que tem um raio de utilizador especificado e limiar acima do fundo local, a máscara é refinada por quebrando intensidades elevadas em pontos individuais usando a função de pico e, em seguida, manchas acima uma intensidade de 200 contagens foram incluídos . Consulte o guia de mascaramento Amnis local para mais informações (Figura 1E). A re estatísticas modelo de porta foi gerada pela inclusão de diversos recursos no menu Relatórios.
- Este ficheiro foi guardado como ficheiro de modelo para ser utilizado para análise por lote de todos os arquivos experimentais.
- No software IDEAS, clique em Ferramentas → Dados de lote arquivos de entrada e todos os arquivos. Rif. Adicione o arquivo de matriz de compensação (. Ctm) eo arquivo de modelo (. Ast) nas seções correspondentes. Envie o lote para processamento. Após o passo de processamento, todos os arquivos. Rif são analisados e arquivos. Daf são gerados para cada um dos ficheiros individuais primas. Um arquivo de relatório final é gerado com as estatísticas de todas as amostras.
Dicas e notas:
- A análise das imagens foi realizada utilizando o IDEAS versão 4.0 do software e do assistente Internalização com algumas modificações. O assistente é auto-instrutivo e ouptput. Arquivo daf pode ser gerado, seguindo as instruções do assistente.
7. Os resultados representativos
"> As imagens representativas na Figura 2 demonstram que CFMI pode ser utilizado com sucesso para distinguir entre internalizado (à esquerda do painel) versus superfície ligada (painel da direita) NP (Figura 2A) ou de Salmonella (Figura 2B). Internalização de NP e Salmonella foram reduzidos por tanto actina inibir e baixando a temperatura a 4 ° C (Fig. 3A). A percentagem de células positivas para a superfície ligada NP aumentou de cerca de 8% a 37 ° C a maior do que 35% após uma citocalasina-D ou 4 tratamento C ° ( Fig. 3B). Em contraste, a percentagem de células com Salmonella superfície ligada foi reduzida de 35% a 15%, após citocalasina-D tratamento. Incubação de células RAW 264.7 com Salmonella a 4 ° C diminuiu internalização sem um aumento aparente na quantidade de superfície ligada bactérias em comparação com o 37 ° C de controlo. Em conjunto, estes dados demonstram que <em> Salmonella e NP são internalizados por um processo similar celular que requer actina e é dependente da temperatura. Além disso, os dados indicam que a ligação sustentada de Salmonella para macrófagos requer polimerização da actina.
Figura 1. Esquemática da estratégia gating utilizado para determinar internalizado contra as nanopartículas de superfície ligados e Salmonella. (A) Para limitar a análise de células individuais, é importante para eliminar os detritos celulares e multi-eventos. Células individuais e doublet foram separados agregados multicelulares usando as ideias área características e relação de aspecto da imagem de campo claro (M01). Área é o tamanho da imagem em microns quadrados e razão de aspecto é o eixo menor dividido pelo eixo maior e, portanto, uma medida de circularidade (um círculo perfeito terá uma relação de aspecto de 1; dupletos têm tipicamente asperácios de TC de cerca de 0,5 e agregados multicelulares são tipicamente menos do que 0,5). A região foi elaborado para a porta em eventos única célula (Passo 6.6). (B) Para portão nas células-foco, as IDÉIAS apresentam Gradiente RMS da imagem de campo claro é representada em um histograma. O gradiente característica RMS mede a qualidade nitidez de uma imagem através da detecção de mudanças de valores de pixel na imagem. Maior gradiente valor RMS indica uma imagem mais focada (Passo 6.7). (C) de fluorescência verde células positivas foram selecionados pela passagem sobre as células com altos valores Pixel Max e intensidade no canal de fluorescência verde (Passo 6.8). (D) Células com NP internalizado ou Salmonella foram selecionados ao escolher a população de células com uma pontuação de internalização igual ou maior do que 0,3. Células que recebem uma pontuação inferior a 0,3 foram considerados como superfície ligada (Passo 6,9). (E) As células do portão "internalizada" foram ainda caracterizados com base no número de manchas (NP ou STM) porque there foram algumas células com coloração de fundo, que foram contadas como internalizado, mas teve um valor de ponto de zero (Passo 6,11). Imagens representativas são apresentadas para cada porta. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Imagens das células da superfície de nanopartículas internalizadas e encadernados (PN) ou Salmonella. (A) imagens representativas de células RAW 264.7 que NP internalizada (painel esquerdo) e as células para que NP foram vinculados à sua superfície, mas não internalizada (painel direito). (B) de representação de imagens células RAW 264.7 que a Salmonella internalizado (painel da esquerda) e células para as quais Salmonella foram ligados à sua superfície, mas não internalizada (painel da direita).
Figura 3. Cytochalapecado-D o tratamento de células inibida internalização de NP e Salmonella. (A) Pré-tratamento das células RAW 264.7 com citocalasina-D ou incubação a 4 ° C reduziu a incidência de internalização NP ou Salmonella, em comparação com células RAW 264.7 incubadas a 37 ° C em meio. RAW 264.7 células incubadas em meio contendo DMSO (isto é, o veículo de controlo) mostraram níveis de internalização semelhantes para NP e Salmonella em comparação com apenas meio (dados não mostrados). (B) Pré-tratamento de células RAW 264.7 com citocalasina-D aumentou a percentagem de células com a superfície ligada NP enquanto diminui a percentagem de células com Salmonella superfície acoplado.
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Discussion
Estudos têm demonstrado que as nanopartículas biodegradáveis à base de poli (ácido láctico-co-glicólico (PLGA), ou polianidridos podem ser utilizados para entregar antigénios encapsulados ou drogas às células alvo. Uptake destas nanopartículas pelas células fagocíticas é importante para a sua eficácia, tornando assim quantitativa . análise de internalização crítico na concepção de novos sistemas de entrega de nanopartículas Ao utilizar este método, a absorção diferencial de nanopartículas por vários tipos de células podem ser analisadas com facilidade Até à data, a microscopia convencional e citometria de fluxo têm sido utilizados para quantificar a absorção de partículas;. no entanto, a sua respectiva limitações com alto rendimento e resolução pedem abordagens alternativas para estudar a internalização. Neste artigo, vamos realizar uma análise CFMI para caracterizar e comparar a forma como o processo biológico de fagocitose difere entre os dois tipos de metas de um nanopartículas bacterianos patogénicos e sintéticas.
O phagocytos CFMIé ensaio foi utilizado para delinear as diferenças de o mecanismo subjacente a absorção de Salmonella em comparação com nanopartículas. Deve notar-se que os inibidores podem ser citotóxico dependendo da sua concentração e tempo de incubação, daí um perfil citotoxicidade antes (isto é, o tempo de exposição e da concentração) é necessária antes da sua utilização 13,14. Dependendo da sua formulação química, as nanopartículas podem ter uma temperatura de transição vítrea (Tg = 13 ° C) abaixo RT, consequentemente, eles formam agregados à TA 15. Para superar a agregação, que sonicada as partículas e manteve-los em gelo antes da adição às culturas de células. Os estudos cinéticos de absorção de nanopartículas fornecer informações importantes sobre a eficiência destas partículas para proporcionar a carga encapsulada para as células apresentadoras de antigénio. Deve ser tomado cuidado para manter as células em gelo no final de um ponto de tempo dado para inibir ainda mais processos celulares. Para este fim, notamos variabilidade na cellular absorção quando as células não foram colocadas em gelo. Uma limitação do método descrito acima é que a experiência é efectuada em células aderentes que requerem raspagem técnicas para colher as células fagocíticas. Este procedimento pode resultar em morte celular, introduzindo assim um erro na análise dos dados. O procedimento descrevemos aqui pode também ser realizada usando células que crescem em suspensão.
A incubação de macrófagos com corantes reactivos ou reagentes imunomarcação foi optimizada através da redução da quantidade de tampão de fixação residual presente seguinte. A presença de tampão residual cria um efeito de diluição da amostra e pode produzir a variação da amostra entre as amostras múltiplas, resultando assim em inconsistentes valores médios de intensidade de fluorescência. Concentração da amostra (isto é, células / ml) também é um fator importante a considerar durante a etapa de aquisição, como resultado diluído amostras em tempos mais executada. Para uma comparação multi-paramétrico entre diferentesAs amostras experimentais, é importante manter a intensidade do laser constante.
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Disclosures
Sherree amigo L. é empregada por Amnis Corporation, que fabrica o sistema X ImageStream.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o Prêmio ONR MURI-(NN00014-06-1-1176) e os EUA Army Medical Research e Material Command (Números Grant W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) para financeira apoiar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| 24-well plate | Techno Plastic Products | 92024 | |
| Cell culture Flasks | Techno Plastic Products | 90151 | |
| Cell scraper | Techno Plastic Products | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Technologies | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma-Aldrich | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
References
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
- Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
- Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
- Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
- Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
- Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
- Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
