Summary
在这篇文章中，我们描述了一种方法，利用多光谱成像流式细胞仪量化酸酐纳米粒子或RAW 264.7细胞细菌的国际化。
Abstract
纳米粒子系统已经出现在疫苗交付有价值的工具，通过他们的能力，有效地交付货物，包括蛋白质，抗原提呈细胞1-5。国际化的纳米粒子的抗原提呈细胞（NP），是在封装的抗原产生有效的免疫反应的关键步骤。为了确定在纳米制定影响功能如何变化，我们寻求开发一种高通量，定量实验的协议，该协议是兼容内在的纳米颗粒以及细菌检测。到今天为止，显微镜和流式细胞仪，两个独立的技术，已用于研究纳米粒子的吞噬功能的方法。流式细胞仪的高通量的性质产生了强大的统计数据。然而，由于分辨率低，不能准确地量化与细胞结合纳米粒子内部。显微镜生成高空间分辨率的图像，H贷款本息偿还期中，它是费时，涉及小样本6-8。多光谱成像流式细胞仪（MIFC）是一种新技术，采用显微镜和流式细胞仪同时执行层的核心，通过多种颜色的光谱荧光和亮场成像方面。此功能提供了一个准确的分析荧光信号强度和高速蜂窝不同的结构和功能之间的空间关系。
在此，我们描述了一个方法，利用MIFC特征的细胞群体的内在酸酐纳米粒子或沙门伤寒。我们还描述了制备纳米粒子悬浮液，细胞标记，ImageStream X系统的采集和分析数据的使用理念的应用。我们也证明了一种技术的应用，可以用来区分国际化带够纳米粒子和细菌athways使用的肌动蛋白介导的吞噬作用的抑制剂细胞松弛素 - D。
Protocol
1。 RAW 264.7巨细胞培养
- 收获RAW 264.7细胞从他们的保温瓶，当他们到达汇合，他们用细胞刮刀轻轻刮。计数和板块他们到1 5 x 10 5细胞密度/以及在完成0.5毫升Dulbecco的修改鹰中等（cDMEM 24孔细胞培养盘; 10％热灭活胎牛血清（FBS），，2毫米Glutamax 10毫米的肝素钠）在5％CO 2培养箱在37℃孵育过夜。
2。致病性沙门氏菌沙门伤寒14028转型与文化
- 介绍到 S表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒。鼠伤寒由电击。首先，准备在LB肉汤文化和沙门伤寒（ATCC 14028）与曝气，在37℃孵育过夜。
- 第二天，颗粒1毫升细菌微量的最大速度。洗细胞FO你轻轻地重新悬浮颗粒之间每次洗9移液器-冷MOPS /甘油溶液1毫升（（N-吗啉）丙磺酸（MOPS）在20％甘油缓冲1毫米3）倍。最后一次洗涤后，悬浮在50μL拖把/甘油进入哪〜0.5微克质粒DNA pAKgfp1或pAKgfplux1已增加了10的颗粒。
- 细胞悬液转移到预冷藏1毫米的差距电试管和electroporate使用的设置：1800 V，200瓦，25 MF。脉冲传递后，立即加入1 mL LB培养基中，细胞悬液转移到一个新的15 mL管。使细胞在37°C与曝气恢复。一个小时后，集中〜100μL，其余上清离心重悬细胞。
- 最后，在LB板含有100μg/ mL氨苄青霉素，并于37一夜之间板细胞°C。单菌落纯化与抗生素的选择和我的GFP表达restreaking科学也证实了照明用一个标准的异硫氰酸荧光素（FITC标记）滤波器组。
- 接种10毫升，用的沙门氏菌 loopful，已经转化为稳定表达的GFP含有25μg/ mL氨苄青霉素（或适当的抗生素）的LB肉汤。
- 一夜之间生长的细菌在37°C。
- 沙门氏菌 1:10稀释成含有10毫升LB氨苄青霉素和孵育5小时，在37°C的新鲜文化管
- 衡量文化的吸收，在600 nm和使用先前建立的生长曲线，计算出每毫升沙门氏菌的浓度。
- 稀释在cDMEM（0.5毫升/） 沙门氏菌获得的感染复数（MOI），RAW 264.7细胞每100。
3。制备的纳米粒子悬浮液
- 编造1％FITC加载描述以前11纳米。简单地说，通过酸酐制备颗粒反溶剂nanoencapsulation的，聚合物溶解在二氯甲烷（4°在浓度为25毫克/毫升）和戊烷（-30℃1:200的比例二氯甲烷：戊烷）沉淀。恢复真空过滤纳米。蒸发任何残留的溶剂后，权衡干酸酐，纳米颗粒使用消毒权衡纸。
- 5毫克的纳米粒子加入0.5毫升的冷磷酸盐缓冲液（PBS，钙和镁的自由，pH值7.4）1.5 mL离心管中，并保持它在冰上直到纳米粒子添加到RAW 264.7细胞。
- 超声纳米粒子悬浮液（保持冰）使用超声波液体处理器，配有微尖约25小号在4至6焦耳。
4。吞噬含量
- 5微克/毫升细胞松弛素- D 1小时前引进NP或沙门氏菌预处理RAW 264.7细胞的一个子集，吸中等和REPL抑制剂补充新鲜cDMEM acing。 37°Ç孵化器返回的文化。
- 抑制剂的1小时孵化后，从孵化器中删除板块，涡纳米粒子悬浮液，加入10μl适当的井。
- 涡沙门氏菌和MOI 100的RAW 264.7细胞，通过添加适当的井的细菌感染。
- 点击几次板，混合和孵育37°C或4°C下45分钟（控制）。
- 删除从孵化器或冰箱和冰的地方板块。与冰冷的PBS洗细胞两次（无钙+和Mg 2 +）的吸气式和抛弃旧的介质，以除去未结合的颗粒， 沙门氏菌 ，死亡或独立RAW 264.7细胞。
- 收获后的第二次洗RAW 264.7细胞，加入250μL冷PBS轻轻刮去井。
- 收获细胞吸取到清晰视图单元帽微离心管中，并保持他们在冰上。
- 洗细胞，加入250×Ğ1毫升冷洗涤缓冲液（2％热灭活胎牛血清，0.1％叠氮钠的PBS）离心10分钟，4°C。
- 纸巾上拍打，倒置离心管，弃上清，并删除剩余的缓冲区。轻轻耙通过试管架离心管，重悬细胞沉淀。
- 在PBS中加入100μL的4％多聚甲醛（PFA）和使细胞站立在室温（RT）15分钟修复RAW 264.7细胞。
- 洗RAW 264.7细胞加入250×Ğ1毫升的权限/洗涤缓冲液（BD Biosciences公司）和离心10分钟，4°C。
- 重复步骤4.9。
- 加入100μl含有的Alexa Fluor 660鬼笔环肽（AF 660; 1:150稀释）彼尔姆/清洗缓冲区的染色RAW 264.7细胞的肌动蛋白在室温为15分钟。重复步骤4.11和4.12。
- RAW 264.7细胞重悬于50μLPBS包含1％PFA和存储他们在黑暗中，在4°C间，直到收购。
提示及注意事项：
- 单一色荧光样品应准备在这一步而设立ImageStream X仪器将用于补偿控制。包括在这个实验中，分别为：RAW 264.7细胞培养与纳米粒子（不标记的肌动蛋白）; 沙门氏菌培养RAW 264.7细胞（肌动蛋白标记）;肌动蛋白只标RAW 264.7细胞的补偿控制。
- 为抑制剂的研究，它是重要的，包括对车辆的控制，作为控制溶解抑制剂。在这个实验中，细胞松弛素D的100％DMSO溶解。因此，我们在cDMEM含DMSO和评估孵育细胞内部的纳米粒子或沙门氏菌 。我们没有发现任何中型组和，二甲基亚砜控制（数据未显示）之间的显着性差异。
- SA的mple准备指南提供的Amnis网站（ https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf ）是一个检查的ImageStream X荧光的兼容性很好的资源。要访问此文件，用户必须先注册（免费的负责人）与阿美族。
5。样品采集ImageStream X
- 最多ImageStream X和发射功率激励。
- 初始化射流。的这个脚本SpeedBeads结束在应该运行。
- 在文件菜单中，选择加载默认的模板。
- 在图片廊视图菜单，选择和按运行安装程序开始成像的珠子。
- 调整的核心跟踪中心的图像横向（如有必要）。
- 选择明场（BF）的通道，并单击“设置强度。
- 等待，直到流动速度的简历一直是乐SS超过0.2％。
- 每天校准仪器。在助攻“选项卡，单击”全部启动运行校准和测试，并确认所有已经过去了。
- 按冲洗锁和负载（FLL）加载的第一个样本。载入中最亮的样本，每个荧光荧光实验。运行此示例，您首先要建立的仪器设置，然后不要更改它们在整个实验，这是关键。
- 打开在实验中使用的每个激光和激光功率设置，所以每个荧光最大像素值在100和4000之间的罪名，在散点图。
- 设置单元格的分类标准，以消除不必要的对象的集合。只有细胞收集数据，高炉到50微米的通道选择区域下的极限。面积小于50微米的对象将被视为碎片并不会被收购。选择要收集的渠道。
- 输入文件名，目标文件夹，设置序列＃1和收购活动。
- 点击运行采集，收集和保存的第一个实验数据文件。
- 点击FLL和运行下的实验样品。重复，直到所有实验样本已收集。
- 点击比赛设置（关闭明和散射的激光，使所有渠道收集），并积极从每个单个的染色样品500每个荧光细胞收集在实验中，以制定一个补偿矩阵。
总结，样品可以运行在以下顺序：
- 明亮的样本。
- 其余测试样品。
- 含有单双色荧光补偿控制。
提示及注意事项：
- 一个的INSPIRE模板可以保存和重新加载设置的仪器设置。一旦模板被保存，自动进样器可用于无人操作运行一个模板和合作的实验样品mpensation控制每个单一色彩控制模板。
- 这些实验：488和658 nm激发激光器的ImageStream X配置; 785纳米散射激光; 40X（0.75 NA）的目标，ISX一个标准的过滤器堆栈6通道系统。使用自动进样器选项允许无人值守采集样品。
- 以下设置被用于实验。纳米粒子被设置到10MW的488纳米激光成像，658 nm激光设置为50毫瓦，785 nm激光设置为2兆瓦和BF在通道1设置为20兆瓦的488纳米激光成像沙门氏菌感染的细胞， 658 nm激光设置为50毫瓦，785 nm激光通道1设置为2兆瓦，和BF。补偿控制在高炉和785的情况下收集。至少5000事件（即细胞），每个测试样品的成像。
6。图像分析
- 推出的创意和国际化的向导和负载上双击E的测试样品。RIF文件。
- 点击“新矩阵”在第2步创建一个补偿矩阵。赔偿向导启动。在实验中添加单一色彩控制文件。通过点击以下方向的向导下，直到补偿矩阵文件保存和装入箱的国际化向导的步骤2。
- 单击“下一步”，并按照方向，直到产生。DAF文件。
- 所选择的图像采集过程中使用的通道设置图像显示属性。点击CH 2（FITC）和CH（自动对焦，660）5。 （BF和SSC是默认选中）。
- 选择图像通道，使细胞边界（CH01）和纳米粒子或细菌就被收集在通道（CH02）。
- 生成一个散点图区明视与明视所有细胞的长宽比。按一下个别的点和门控周围汗衫定义的单个细胞的人口。单细胞的宽高比第1轮和双峰0.5左右（ 图1A）。
- 明场梯度根直方图的意思是明的形象广场（RMS）的生成和人口在图片库视图设置选择彬（ 图1B）。点击垃圾箱，以确定最佳焦点细胞开始画线区域门集中细胞。较高的RMS梯度，更好地集中。除非有其他你想门上的污渍，跳过下一步。
- 产生一个新的分散强度频道2 x轴与最大像素y轴CH2情节（ 图1C）。点击点和查看图像，以帮助你周围绘制，积极为纳米粒子或细菌细胞的区域。
- 一个国际化的特征直方图产生的一个地区，从0开始，通过观察图像（ 图1D）应调整。国际化的特点是比整个细胞的强度在细胞内的强度。据缩放等，约一半的强度为0的价值就在里面。向导创建了一个区域内指定一个从第5步使用发现细胞表面的细胞图像输入和侵蚀这个由4个像素的面具。请注意，此面膜可以手动为不同类型的细胞在必要时调整。在这个实验中，我们先明图像上创建一个对象的遮罩，手动调整功能，并削弱由这4个像素。国际化的特征，然后计算这4个像素的侵蚀对象面具。此功能使我们能够区分内在的细菌和微粒，其中有大部分遮罩边界内的荧光信号，从表面结合的微粒和细菌，其中有多数外面罩的边界（ 图2）荧光信号。
- 创建一个新的国际化的有限元分析的新的直方图TURE侵蚀的对象遮罩的基础上。通过查看在选定的bin模式的图像，绘制一个区域内在细胞的门。在我们的实验中，我们设置在0.3这个门。得分比0.3更低的细胞被认为是阳性细胞表面结合粒子。
- 最后，消除背景标签的细胞，并确定具体的内在纳米粒子或细菌，思想现货计数功能使用。现货计数是一个功能，连接组件或图像中的小口罩的数量计数。遮罩功能，现货，山顶和强度来定义的斑点。被列入当场面具发现有用户指定的半径和阈值高于当地背景的图像中明亮的细节，面具被分裂成个别景点，山顶的功能，然后点以上200计数强度高强度细化。看到的Amnis点掩蔽指南的进一步资料（ 图1E）。统计重端口模板生成的，包括“报告”菜单中的各种功能。
- 此文件被保存为模板文件，将一批文件，所有的实验分析。
- 在思想的软件，单击“工具→批量数据文件和输入所有。RIF文件。加入补偿矩阵文件（CTM）和模板文件中的相应部分（AST）。提交一批加工。处理步骤后，所有。RIF文件进行了分析和DAF文件为每个个别的原始文件生成。最后报告文件生成与所有样本的统计数据。
提示及注意事项：
- 图像分析进行思想软件4.0版和一些修改的国际化向导。向导是自我启发和产生的ouptput。DAF文件可以按照向导中的说明。
7。代表结果
“> 图2中的代表图像，证明是的MIFC可以被用来成功区分内在（左图）与表面结合（右图），NP（ 图2A）或沙门氏菌 （ 图2B）减少了国际化的NP和沙门氏菌 。既抑制肌动蛋白和温度降低到4°C（ 图3A）。的NP势必表面呈阳性的细胞百分比增加约8％，在37°C大于35％后，无论是松弛素D或4°C处理（ 图3B）。相比之下，与细胞表面结合沙门氏菌的比例从35％降低至15％后，细胞松弛素-D治疗。 沙门氏菌的RAW 264.7细胞的潜伏期在4°C降低内部没有明显增加金额表面约束的细菌相比，到37°C控制。一起，这些数据表明，<EM>沙门氏菌和NP内部由一个类似的肌动蛋白细胞的过程，需要是温度依赖。此外，数据表明， 沙门氏菌巨噬细胞的持续附件需要肌动蛋白聚合。
图1。用来确定内部与表面结合的纳米粒子和沙门氏菌浇注战略示意图 （a）限制单细胞分析，重要的是要消除碎片和多细胞活动。单细胞和双峰分离从思想功能区和明（M01）的长宽比的多细胞聚集。面积是平方微米的图像宽高比的大小是短轴，长轴，因此衡量一个圆（一个完美的圆圈，将有1宽高比分为双峰通常有ASPE克拉比0.5左右，是典型的多细胞聚集小于0.5）。一个地区被吸引到门单细胞活动（步骤6.6）。 （B）为焦点细胞的大门，思想具有梯度明形象的RMS在绘制直方图。通过检测图像中的像素值的变化梯度RMS功能测量图像的清晰度质量。梯度较高的RMS值表明一个更集中的图像（步骤6.7）。 （三）选择绿色荧光阳性细胞细胞上具有较高的最大像素值和强度在绿色荧光通道（步骤6.8）的门。 （四）具有内在的NP或沙门氏菌细胞通过选择一个国际化的得分等于或大于0.3的细胞群。细胞接收分数低于0.3被认为是表面的约束（步骤6.9）。 （五）在“内在的”闸门细胞的进一步特点的基础上斑点的数量（NP或STM），因为疗法E是一些背景染色细胞计数为内在的，但有一个点值为零（步骤6.11）。代表性的图像，每个门。 点击这里查看大图 。
图2。内在的和表面的束缚粒子（NP）或沙门氏菌的细胞图像。（一）内在NP（左侧面板）和细胞的NP绑定到其表面，而不是内在（右图）的RAW 264.7细胞的代表图像。 （二）内在沙门氏菌 （左图）和细胞沙门氏菌绑定到其表面而不是内在（右图）的RAW 264.7细胞的代表图像。
图3。 cytochala罪三维细胞治疗抑制NP和沙门氏菌的国际化。（一）预处理RAW 264.7细胞与细胞松弛素-D 或潜伏期在4°C降低发病率相比，在37°C培养基中培养的RAW 264.7细胞的NP或沙门氏菌的内在。 NP和沙门氏菌的RAW 264.7细胞中含有二甲基亚砜（即车辆控制）培养基表明类似的国际化水平相比，中等单独（数据未显示）。 （二）增加的RAW 264.7细胞与细胞松弛素-D预处理细胞表面的NP约束，同时减少与细胞表面结合沙门氏菌 ％％。
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Discussion
有研究表明，聚（乳酸 - 乙醇酸共聚物（PLGA）或酸酐为基础的可生物降解的纳米粒子可以被用于运载包裹抗原或药物靶细胞，其成效是非常重要的吞噬细胞，这些纳米粒子吸收，从而使定量国际化，设计新颖的纳米给药系统的关键，通过使用这种方法。分析，由多种细胞类型的纳米粒子吸收差可以轻松地分析至目前为止，已量化粒子吸收传统的显微镜和流式细胞仪。然而，各自的替代的方法来研究国际化的高吞吐量和决议呼叫限制。在这篇文章中，我们执行MIFC分析特点和比较，吞噬的生物过程如何两类目标的细菌病原体和合成纳米之间的不同。
MIFC phagocytos法用来划定的基本机制的的沙门氏菌吸收到纳米粒子相比差异。应当指出，抑制剂可以杀伤他们的孵化时间和浓度而定，因此事先细胞毒性分析（即，暴露时间和浓度）是必要的，之前，他们使用13,14。根据他们的化学配方，纳米粒子可以有一个玻璃化转变温度（TG = 13℃）以下逆转录，因此，他们形成了聚集在室温15。要克服的聚集，我们超声颗粒，并保持他们之前除了细胞培养上冰。纳米粒子吸收的动力学研究提供重要信息，这些粒子提供封装的负载抗原提呈细胞的效率。必须小心保持在一个给定的时间点上冰的细胞，进一步抑制细胞过程。为此，我们已经注意到cellula变异ŕ摄取时，细胞置于冰上。上述方法的一个限制是需要刮痧技术，收获的吞噬细胞的贴壁细胞进行实验。这个过程可能会导致细胞死亡，从而在数据分析中引入一些错误。此处描述的过程中，我们也可以使用悬浮生长的细胞。
活性染料的巨噬细胞或免疫标记试剂孵化进行了优化，以减少目前剩余的缓冲以下固定金额。剩余缓冲区的存在，创建一个稀释作用，并能产生样品，来样多个样品之间的差异，从而导致不一致的平均荧光强度值。样品浓度（即细胞/ mL）稀释样品在较长的运行时间，考虑在收购步骤，也是一个重要因素。对于不同的多参数的比较实验样本，它是重要的激光强度保持恒定。
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Disclosures
sherree研究的朋友受雇于Amnis公司，该公司生产ImageStream X系统。
Acknowledgments
作者要感谢金融羚羊的穆里奖（NN00014-06-1-1176）和美国陆军医学研究和装备司令部（批准号W81XWH-09-1-0386和W81XWH-10-1-0806）支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| 24-well plate | Techno Plastic Products | 92024 | |
| Cell culture Flasks | Techno Plastic Products | 90151 | |
| Cell scraper | Techno Plastic Products | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Technologies | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma-Aldrich | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
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