Summary
Ilaçlar, büyüme faktörleri ve / veya yara tamir bir hayvan modelinde manipüle hücrelerin etkilerini analiz etmek için yararlı bir araç tanımlanmıştır. Bu teknik sunar ve içeren ve ayrıca arzu edilen tedavi çıkarıldı ve analiz edilmesi için bir platform sağlamak için bir polivinil alkol (PVA) sünger özellikleri kullanmaktadır.
Abstract
Yara iyileşmesi birçok hücre tipleri, büyüme faktörleri ve 1-3 bileşikleri içeren karmaşık, çok aşamalı bir süreçtir. In vivo olarak yürütülen zaman Çünkü bu karmaşıklık, yara iyileşmesi çalışmaları en kapsamlı vardır. In vivo insizyonel, eksizyonel, ölü boşluk dahil olmak üzere akut yara iyileşmesi, çalışma mevcut modeller, ve yanık birçok vardır. Ölü boşluk modelleri yara dokusu oluşumu ve maddelerin etkilerini incelemek amacıyla kullanılan yapay gözenekli implantlar vardır. Yaygın olarak kullanılan ölü boşluk Bazı modellerin polivinil alkol (PVA) süngerler, çelik hasır silindir, genişletilmiş politetrafloroetilen (ePTFE) malzeme ve Cellstick 1,2 içerir.
Her ölü alan model, malzemenin kompozisyonu ve implantasyon yöntemlerine dayalı kendi sınırlamaları vardır. Çelik hasır silindirli model implantasyonu sonrası infiltrasyon bir lag fazı vardır ve granülasyon dokusu oluşumu Begi önce uzun bir zaman gerektirirns 1. Yara iyileşmesi ileriki aşamalarında en iyi ePTFE modeli 1,4 kullanılarak analiz edilmektedir. Cellstick tipik insan ameliyat yaraları çalışmak için kullanılan ve akışkan 2 sarılır bir silikon tüp model içinde bir selüloz sünger. Süresi ile 5 hayvan dev bir hücre reaksiyonu neden olan bir yabancı cisimlerin tepkisi provoke başlar, çünkü PVA sünger, akut çalışmaları ile sınırlıdır. Diğer malzemelerin aksine, PVA sünger takmak ve çıkarmak, inert ve biyolojik malzemelerden yapılan ve henüz histolojik analiz için 2,5 kesitli olmak için yeterince yumuşak kolaydır.
Yara olarak PVA sünger şifa granülasyon dokusu oluşumu analiz etmek için çok yararlıdır, kollajen depolanması, yara sıvısı kompozisyon ve iyileşme süreci 1,2,5, kimyasal maddelerin etkileri. Yara iyileşmesi niteliklerini geniş bir dizi okuyan içinde kullanımı yanı sıra, PVA sünger, aynı zamanda çalışmaları diğer birçok türde kullanılmıştır. Bu holarak tümör anjiyogenezi, ilaç dağıtım ve kök hücre sağkalım ve engraftman 1,2,6,7 araştırmak için kullanılmıştır. Onun büyük alterability, önceden yaygın olarak kullanılması ve tekrarlanabilir sonuçlar ile, PVA sünger pek çok çalışmada 1,2 için ideal bir modeldir.
Burada, hazırlık, implantasyon ve yara iyileşmesi bir fare modelinde PVA sünger diskler (Şekil 1) alımı anlatacağız.
Protocol
1. Sünger Hazırlama
- % 0.9 (w / v) doymuş sulu sodyum klorür çözeltisi gece boyunca karıştırıldı hidrat süngerler.
- Onları otoklavlayarak sulu sünger sterilize edin. 121 azından 25 dakika süreyle 75 mL, otoklav ° C.
Not: aşağıda tarif edildiği gibi bir tedavi ile Yükleme süngerler, isteğe bağlıdır.
- Steril alet ile steril bir başlık, bir cımbız kullanarak çözüm itibaren bir sünger pick up. Cımbız ile süngeri sıkın ve sünger mümkün olduğunca çözüm kaldırmak için bir vakum ucu kullanın. Süngerler arasında boşluk bırakmak için dikkatli olmak, bir doku kültürü çanak sünger dışarı sıkılmış yerleştirin. Çoklu kuyucuğu farklı tedavilerin ayırmak için kullanılabilir.
- Doğrudan bir sünger merkezi üzerine tedavisi çözeltisi Pipeti. Çözüm sünger yerleştirildi sonra pipet süngeri hafifçe bastırın, bu sünger çözüm absorbe yardımcı olur. Not: 6mmKullandığımız 2.75 mm kalınlığında sünger tarafından çapı 25 ul maksimum tutun edebiliyoruz.
- Tüm süngerler yüklendikten sonra onlar fare implante kadar, içinde bulundukları plaka buz üzerinde saklanabilir.
2. Cerrahi Prosedür
- Uygun hayvan uyutmak ve önleyici analjezik yönetmek. Bütün prosedür hayvan başına yaklaşık 20 dakika sürecek. Ile oksijen dakikada 30 g fare 1.5 litre için İzofluran% 1.5 anestezi teşvik ve korumak için kullanılır. Hayvan artık tutam refleks testi, yatar pozisyonda burun konisi yer duyarlı olduğu zaman. Göğüs kafesi altındaki alt ventral tarafta alana 1 inç tarafından 1 inç tıraş için elektrikli tıraş makinesi kullanın. Kesim saç silerek temizleyin.
- % 70 alkol takip betadin ile temizleyerek traş alanı sterilize edin. Bu betadin-alkol temizlik üç kez tekrarlayın.
- Cilt tutan öğretti iken, dikey bir kesi 1.5-2 kat dia yapmak için neşter kullanınsünger metre vücut boşluğunda kesmek için değil temkinli olma, eklenecek.
- Tenine tutmak için bir cımbız kullanmak ve yavaş Metzembaum makasla kesi her iki tarafında kas cilt ayırma başlar. Cep arka ayakları ile fare genişliği boyunca ve göğüs kafesi gitmek gerekir.
- Taraftan hafifçe sıkıştırarak hayvan yerleştirilmesini ilk süngeri almak için bir cımbız kullanın. Bunun üst ve alttan tutulur, böylece bir düz cımbızla için sünger transfer edin.
- Tenine tutmak ve sünger eklenir, böylece bir şekilde kaldırmak için cımbız kullanın. Yavaş yavaş onu sünger doku dokundu sonra taşımak zor olacaktır altındaki ve deri veya kas dokunmadan çalışan sünger yerleştirin. Tüm süngerler için tekrarlayın.
- Bir kez tüm süngerleri yerine insizyon kapatmak için, iki veya üç dikiş eklenmiş. Birlikte kesi her iki tutun ve sutu iplik cımbız kullanınCildin her iki katmanları üzerinden yeniden. Deri kenarları kapatmak için yeterli İlk atışta sıkın. Bir daha diğer yönü, sıkı düğüm çekerek bu sefer atışı ile kare düğüm bitirin. Sonra sütür (Şekil 2) bitirmek için iki kare knot kravat. Tüm insizyon kapatmak için ek sütürler yerleştirin. Diğer yara bağ yöntemleri gibi dermabond, yara klipler, ya da zımba olarak kullanılabilir.
- Anestezi sisteminden hayvan çıkarın ve bilinç devam ederken izlemek. Hayvan hızlı yürüyebilen başlayacak ve pre-op hareketlilik dönmelidir. Yeterince yiyecek ve su ulaşabiliyorlar emin olmak. Bazı nemlendirilmiş gıda geri kazanım yardımcı kafesinin alt yerleştirilebilir. Sıkıntı veya rahatsızlık belirtileri için günlük hayvan izlemeye devam edin ve infeksiyon, inflamasyon ve açılması için kesi yeri kontrol edin. Kurtarma için herhangi bir komplikasyon bulunursa gerekli işlemi yapın.
3. İsteğe bağlı Enjeksiyon
- Istenen bir çözüm sünger enjekte için, önce fare yönetmek için maddenin miktarını belirlemek. Madde enjeksiyon hacmi yarısından az toplam hacmi tutabilir sünger olacak şekilde konsantre edilmesi gerekmektedir.
- Enjeksiyon (bir 28 G iğne kullanmak fare için) bir şırınga hazırlayın.
- Anestezi altında enjeksiyonlar almak için hayvan yerleştirin.
- Hayvan artık kıskı testi yanıt zaman püskürtme verilebilir.
- Enjeksiyon sünger merkezinde 45 derecelik bir açıyla kapsamlı deriyi iğne itin vermek. Sonra sadece yarım gidiyor sünger içine iğne itinkalınlığı boyunca. Amaç sünger tam merkezine enjekte edilmesidir.
- Iğne sünger olduğundan emin olmak için kontrol etmek için, yavaş yavaş dikey iğne kaldırın. İğne sünger ise, sünger iğne ile hareket etmesi gerekir.
- Yavaşça sünger içine enjekte ve iğne çıkarılır. Enjeksiyonları gerektiren birden süngerler varsa bu sıvı enjekte bazı enjeksiyon önceki sitelerin basılmış olacaktır mümkündür.
4. Sünger Kaldırma
Not: sünger çıkartılması sırasında, ekstra dikkatli sünger anlaştım. Cerrahi aletler ile sünger nüfuz kaçının ve çevre doku çapında büyük arterler kaçınarak süngeri aşırı kanama engeller.
- Hayvan ötenazi sonra, bir cımbız kullanarak ve bir kesi sünger yakın hale cilt tutarak sünger kaldırın.
- Çevreleyen kapsül gelen süngerler dikkatle ayırın nd sünger çevreleyen ekstra doku hasat kaçının. Bu tür ilaç dağıtım veya morfometri gibi testlerde, az doğruluk eksizyonu için gereklidir.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Kaldırılır süngerler yapılacaktır analiz türüne bağlı olarak farklı koşullar altında muhafaza edilebilir. Kesit için, alınan süngerler gibi Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşik olarak dondurulması için orta gömülü olabilir veya parafin bloklar (Şekil 3A ve B) gömülmesi, kesit% 10 formalin yerleştirilir. Sünger çapı boyunca ikiye kesip (Şekil 4A ve B) yüzey kısmak gömülü olduğunda kesimi için iyi sonuçlar elde edilir. Sünger olduğu tüm genişliği mevcutsa bu nedenle sünger bölümleri alınmalıdır. Şekil 3A, iki süngerler gösterir, sol sünger gömülü / kesitli yanlış ve sağda düzgün sünger işlendi edildi.
ent "> işlem için hazır olana kadar analiz için, süngerler bir Eppendorf tüp yerleştirilebilir ve -20 ° C'de muhafaza RNA ve kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi süngerler bir Eppendorf tüp, flaş dondurulmuş, yerleştirilir ve saklanmalıdır için. - Buna ek olarak 80 ° C'ye, örneğin QIAGEN gelen RNAlater gibi, bir RNA koruyucu madde, daha yüksek sıcaklıklarda, güvenli depolama için RNA stabilize etmek için kullanılabilir. Yara sıvısı bir tüp içinde süngerler sıkma ile toplanmış, ve gelen sıvının bir araya birleştirilmesi edilebilir temsili bir numune elde etmek için birden fazla süngerler. gibi fibroblast, makrofaj ve lenfosit gibi Canlı hücreler, ayrıca süngerler elde edilebilir. hayvan çıkarıldıktan sonra, sünger hücrelerinin istenen türü için uygun bir ortam içinde yer olabilir. Süngerler olabilir Fiziksel (yani kıyma) veya enzimatik (yani kollajenaz) yöntemleri ile hücreleri çıkarmak için işlenir.
Şekil 1. DehidratasyonaÜç farklı boyutta ted PVA sünger diskler.
Şekil 2. Yanal yara ve dört PVA sünger konumunu gösteren fare yara iyileşmesi modeli resmi.
Şekil 3. 4x (A) H & E boyama ve kesitler parafin sünger 10x (B) trikrom.
Şekil 4. (A) çapı boyunca yarısında sünger kesim resmi. (B) PVA sünger yarısında, Ekim yan kısmak gömülü.
Discussion
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
PPy için Gazi İşleri liyakat ödülü; Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe R01-HL088424 tarafından sağlanan fon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
- Efron, D. T., Barbul, A.
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
