Summary

In vitro Mesothelial Ontruiming Assay dat de modellen van de vroege stappen van eierstokkanker Metastase

Published: February 17, 2012
doi:

Summary

De mesotheelcellen klaring test hier beschreven maakt gebruik van fluorescent gelabelde cellen en time-lapse video-microscopie kwantitatief te visualiseren en meten van de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen. Deze test modelleert de eerste stappen van eierstokkanker metastase.

Abstract

Eierstokkanker is de vijfde belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten 1. Ondanks een positieve eerste reactie op therapieën, 70 tot 90 procent van de vrouwen met eierstokkanker te ontwikkelen nieuwe uitzaaiingen, en de herhaling is vaak dodelijk 2. Het is daarom nodig om te begrijpen hoe secundaire uitzaaiingen ontstaan ​​om betere behandelingen voor tussen-en late stadium eierstokkanker te ontwikkelen. Eierstokkanker uitzaaiing ontstaat wanneer kwaadaardige cellen los te maken van de primaire tumor en de verspreiding van de hele buikholte. De verspreide cellen kunnen vormen meercellige clusters, of sferoïden, die ofwel blijft onthecht, of implantaat op organen in de buikholte 3 (figuur 1, Film 1).

Alle organen in de buikholte zijn bekleed met een enkele, continue, laag van mesotheelcellen 4-6 (figuur 2). Echter mesotheelcellen ontbreken van onderperitoneale tumor massa's, zoals blijkt uit electronen microscoop studies van weggesneden menselijk tumorweefsel secties 3,5-7 (figuur 2). Dit suggereert dat mesotheelcellen zijn uitgesloten van onder de tumormassa door een onbekende proces.

Vorige in vitro experimenten toonden aan dat de primaire eierstokkanker cellen efficiënter te hechten aan extracellulaire matrix dan mesotheelcellen 8, en meer recente studies is gebleken dat primaire peritoneale mesotheelcellen eigenlijk een barrière te verstrekken aan eierstokkanker celadhesie en invasie (in vergelijking met adhesie en invasie op substraten die niet waren bedekt met mesotheelcellen) 9,10. Dit zou betekenen dat mesotheelcellen fungeren als een barrière tegen eierstokkanker metastase. De cellulaire en moleculaire mechanismen die eierstokkanker cellen inbreuk pleegt op deze barrière, en exclusief de mesothelium hebben, tot voor kort nog onbekend.

Hier beschrijven we ee methode voor een in vitro assay dat modellen de interactie tussen ovarium kankercellijn sferoïden en mesotheelcellen in vivo (figuur 3 Film 2). Ons protocol werd aangepast van vroeger beschreven methoden voor het analyseren van ovariële tumor cel interacties met mesotheelcellen monolagen 8-16, en werd voor het eerst beschreven in een rapport waaruit blijkt dat het ovariële tumor cellen maken gebruik van een integrine-afhankelijke activering van myosine en trekkracht, met uitsluiting van de bevordering van mesotheelcellen van onder een tumor sferoïde 17. Dit model maakt gebruik van time-lapse fluorescentie microscopie om toezicht te houden de twee celpopulaties in real time en biedt ruimtelijke en temporele informatie over de interactie. De ovarium kankercellen drukken rood fluorescent eiwit (RFP) terwijl de mesotheelcellen drukken green fluorescent protein (GFP). RFP expressie ovarium kankercellijn sferoïden hechten aan de GFP expressie mesotheelcellen monolaag. De sferoïden verspreiding, binnen te vallen, endwingen mesotheelcellen opzij een gat in de monolaag. Dit gat is weergegeven als de negatieve ruimte (zwart) in de GFP beeld. De oppervlakte van de opening kan dan worden gemeten kwantitatief te analyseren verschillen in afstand activiteit tussen controlegroep en populaties van ovariumkanker en / of mesotheelcellen. Deze test vereist slechts een klein aantal van eierstokkanker cellen (100 cellen per sferoïde X 20-30 sferoïden per conditie), zodat het haalbaar is om deze test met behulp van kostbare primaire tumor cel monsters uit te voeren. Bovendien kan deze assay gemakkelijk worden aangepast voor high throughput screening.

Protocol

1. Ovarian Cancer Cell Spheroid Vorming RFP expressie ovariumkanker cellen gekweekt in 10% basismedium (een maat celkweekmedium bevattende een 50:50 mengsel van 199 en MCDB105 10% geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% pen-strep). Om RFP uitdrukken gelabelde ovarium kankercellen transfecteren de cellen met een plasmide dat RFP en selecteren cellen die RFP. Als alternatief kan virale vectoren worden gebruikt om op transiënte drukken fluorescente eiwitten en cellen kan vooraf geïncubeerd met een fluorescere…

Discussion

De "Mesothelial Clearance Assay" hier gepresenteerde maakt gebruik van time-lapse microscopie te zien op de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen, in grote ruimtelijke en temporele detail. Eerder had een aantal groepen 8-14 gebruikt eindpunt testen aan te tonen dat eierstokkanker cellen hechten aan en binnen te vallen in mesotheelcellen cel monolagen. Deze test is uniek omdat het gebruikt fluorescent gelabelde cellen te onderscheiden tumorcellen van m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen graag de Nikon Imaging Center aan de Harvard Medical School, in het bijzonder Jennifer Waters, Lara Petrak en Wendy Zalm, voor de opleiding en het gebruik van hun timelapse microscopen bedanken. Wij zouden ook graag Rosa Ng en Achim Besser bedanken voor waardevolle discussies. Dit werk werd ondersteund door NIH Grant 5695837 (tot M. Iwanicki) en GM064346 aan JSB, door een subsidie ​​van Dr Miriam en Sheldon Adelson G. Medical Research Foundation (tot GCO).

Materials

Reagent Company Catalog Number Comments
OVCA433 Ovarian Cancer Cells     Gift from Dr. Dennis Slamon
ZT Mesothelial Cells     Gift from Dr. Tan Ince
Medium 199 Gibco 19950  
MCDB105 Cell Applications Inc. 117-500  
FBS-heat inactivated Gibco 10082  
Pen-Strep Gibco 15070  
96 well plates Corning Costar 3799  
Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) Sigma Aldrich 192066-25G For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH
EtOH Pharmco-aaper 111ACS200 Dilute to 95% in dH20
Cell culture hood Nuaire NU-425-300  
Tissue culture incubator Thermo Scientific 3110  
incubator for poly-HEMA plates Labline Instruments Imperial III 305  
Tabletop centrifuge Heraeus 75003429/01  
6 well glass-bottom dish MatTek corp. P06G-1.5-20-F  
Fibronectin Sigma F1141-1MG  
PBS Cellgro 21-040-CV  
Timelapse Microscope:      
Microscope Nikon   Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System
Lens Nikon   20X-0.75 numerical apeture
Halogen transilluminator Nikon   0.52 NA long working distance condenser
Excitation and emission filters Chroma single pass filters in Nikon housing   GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50
Transmitted and Epifluoresce light path Sutter   Smart Shutters
Linear-encoded motorized stage Nikon    
Cooled charged-coupled device camera Hamamatsu ORCA-AG  
Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control custom-built    
Vibration isolation table TMC  
NIS-Elements software Nikon   Version 3

References

  1. Jemal, A. . CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , (2007).
  3. Burleson, K. M. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  4. Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
  5. Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).
  6. Zhang, X. Y. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).
  7. Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
  8. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
  9. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  10. Ksiazek, K. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
  11. Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).
  12. Heyman, L. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).
  13. Heyman, L. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502 .
  14. Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).
  16. Leroy-Dudal, J. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).
  17. Iwanicki, M. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
  18. Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
  19. Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
  20. Roberts, P. C. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
  21. Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
  22. Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).
  23. Brandt, B. 3D-extravasation model — selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).
  24. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).
  25. Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
  26. Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).
  27. Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).

Play Video

Cite This Article
Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (60), e3888, doi:10.3791/3888 (2012).

View Video