De mesotheelcellen klaring test hier beschreven maakt gebruik van fluorescent gelabelde cellen en time-lapse video-microscopie kwantitatief te visualiseren en meten van de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen. Deze test modelleert de eerste stappen van eierstokkanker metastase.
Eierstokkanker is de vijfde belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten 1. Ondanks een positieve eerste reactie op therapieën, 70 tot 90 procent van de vrouwen met eierstokkanker te ontwikkelen nieuwe uitzaaiingen, en de herhaling is vaak dodelijk 2. Het is daarom nodig om te begrijpen hoe secundaire uitzaaiingen ontstaan om betere behandelingen voor tussen-en late stadium eierstokkanker te ontwikkelen. Eierstokkanker uitzaaiing ontstaat wanneer kwaadaardige cellen los te maken van de primaire tumor en de verspreiding van de hele buikholte. De verspreide cellen kunnen vormen meercellige clusters, of sferoïden, die ofwel blijft onthecht, of implantaat op organen in de buikholte 3 (figuur 1, Film 1).
Alle organen in de buikholte zijn bekleed met een enkele, continue, laag van mesotheelcellen 4-6 (figuur 2). Echter mesotheelcellen ontbreken van onderperitoneale tumor massa's, zoals blijkt uit electronen microscoop studies van weggesneden menselijk tumorweefsel secties 3,5-7 (figuur 2). Dit suggereert dat mesotheelcellen zijn uitgesloten van onder de tumormassa door een onbekende proces.
Vorige in vitro experimenten toonden aan dat de primaire eierstokkanker cellen efficiënter te hechten aan extracellulaire matrix dan mesotheelcellen 8, en meer recente studies is gebleken dat primaire peritoneale mesotheelcellen eigenlijk een barrière te verstrekken aan eierstokkanker celadhesie en invasie (in vergelijking met adhesie en invasie op substraten die niet waren bedekt met mesotheelcellen) 9,10. Dit zou betekenen dat mesotheelcellen fungeren als een barrière tegen eierstokkanker metastase. De cellulaire en moleculaire mechanismen die eierstokkanker cellen inbreuk pleegt op deze barrière, en exclusief de mesothelium hebben, tot voor kort nog onbekend.
Hier beschrijven we ee methode voor een in vitro assay dat modellen de interactie tussen ovarium kankercellijn sferoïden en mesotheelcellen in vivo (figuur 3 Film 2). Ons protocol werd aangepast van vroeger beschreven methoden voor het analyseren van ovariële tumor cel interacties met mesotheelcellen monolagen 8-16, en werd voor het eerst beschreven in een rapport waaruit blijkt dat het ovariële tumor cellen maken gebruik van een integrine-afhankelijke activering van myosine en trekkracht, met uitsluiting van de bevordering van mesotheelcellen van onder een tumor sferoïde 17. Dit model maakt gebruik van time-lapse fluorescentie microscopie om toezicht te houden de twee celpopulaties in real time en biedt ruimtelijke en temporele informatie over de interactie. De ovarium kankercellen drukken rood fluorescent eiwit (RFP) terwijl de mesotheelcellen drukken green fluorescent protein (GFP). RFP expressie ovarium kankercellijn sferoïden hechten aan de GFP expressie mesotheelcellen monolaag. De sferoïden verspreiding, binnen te vallen, endwingen mesotheelcellen opzij een gat in de monolaag. Dit gat is weergegeven als de negatieve ruimte (zwart) in de GFP beeld. De oppervlakte van de opening kan dan worden gemeten kwantitatief te analyseren verschillen in afstand activiteit tussen controlegroep en populaties van ovariumkanker en / of mesotheelcellen. Deze test vereist slechts een klein aantal van eierstokkanker cellen (100 cellen per sferoïde X 20-30 sferoïden per conditie), zodat het haalbaar is om deze test met behulp van kostbare primaire tumor cel monsters uit te voeren. Bovendien kan deze assay gemakkelijk worden aangepast voor high throughput screening.
De "Mesothelial Clearance Assay" hier gepresenteerde maakt gebruik van time-lapse microscopie te zien op de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen, in grote ruimtelijke en temporele detail. Eerder had een aantal groepen 8-14 gebruikt eindpunt testen aan te tonen dat eierstokkanker cellen hechten aan en binnen te vallen in mesotheelcellen cel monolagen. Deze test is uniek omdat het gebruikt fluorescent gelabelde cellen te onderscheiden tumorcellen van m…
The authors have nothing to disclose.
We willen graag de Nikon Imaging Center aan de Harvard Medical School, in het bijzonder Jennifer Waters, Lara Petrak en Wendy Zalm, voor de opleiding en het gebruik van hun timelapse microscopen bedanken. Wij zouden ook graag Rosa Ng en Achim Besser bedanken voor waardevolle discussies. Dit werk werd ondersteund door NIH Grant 5695837 (tot M. Iwanicki) en GM064346 aan JSB, door een subsidie van Dr Miriam en Sheldon Adelson G. Medical Research Foundation (tot GCO).
Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
Medium 199 | Gibco | 19950 | |
MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
Timelapse Microscope: | |||
Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
Vibration isolation table | TMC | ||
NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |