Burada anlatılan mezotel klirensi tayini floresan ile işaretlenmiş hücreler ve zaman atlamalı video mikroskopi görselleştirmek ve kantitatif yumurtalık kanseri çok hücreli sferoidler ve mezotel hücre tek katmanlarının etkileşimleri ölçmek için yararlanır. Bu test yumurtalık kanseri metastaz erken adımları modeller.
Over kanseri Amerika Birleşik Devletleri 1 kansere bağlı ölümlerin beşinci önde gelen nedenidir. Tedavilere olumlu bir ilk yanıt rağmen, yumurtalık kanseri olan kadınların 70 ila 90 oranında yeni metastaz geliştirmek ve nüks genellikle 2 ölümcüldür. Bu, orta ve geç evre yumurtalık kanseri için daha iyi tedaviler geliştirmek için ikincil metastazlar ortaya nasıl anlamak için, bu nedenle gereklidir. Malign hücrelerin primer tümörün sitesinden ayırmak ve periton boşluğuna genelinde yaygınlaştırmak zaman yumurtalık kanseri metastazı oluşur. Dissemine hücrelerin periton boşluğuna 3 (Şekil 1, Movie 1) içindeki organlar üzerine çok hücreli kümeleri, ya da küresel cisimler, ya kalır ayrıldığı edecek, ya da implant oluşturabilir.
Periton boşluğu içinde organlarının Tüm mezotel hücreleri 4-6 (Şekil 2) bir tek, sürekli, tabaka ile kaplıdır. Ancak, mezotel hücre altından bulunmadığınaolarak eksize insan tümör doku kesitlerinde 3,5-7 (Şekil 2) elektron mikroskobu çalışmalarla ortaya peritoneal tümör kitleleri,. Bu mezotel hücreler bilinmeyen bir işlem tarafından tümör kitlesi altında dışında olduğunu göstermektedir.
In vitro deneylerde Önceki primer over kanseri hücreleri 8 mezotel hücrelere daha ekstraselüler matriks daha verimli takın ve daha yeni çalışmalar primer periton mezotel hücreleri aslında yumurtalık kanseri hücre adezyon ve invazyon (as adhezyon ve invazyon göre bir bariyer sağlamak gösterdi gösterdi ) mezotelyal hücrelerle 9,10 kapsamı dışında kalan yüzeylerde. Bu mezotel hücreleri yumurtalık kanseri metastazı karşı bir bariyer görevi öneririm. Yumurtalık kanseri hücreleri bu engeli ihlal ve sahip mesothelium hariç hangi hücresel ve moleküler mekanizmalar, yakın zamana kadar bilinmeyen kaldı.
İşte biz th tarifin vitro bir e metodolojisi bu modeller in vivo (Şekil 3, Movie 2) yumurtalık kanseri hücre sferoidler ve mezotel hücreleri arasındaki etkileşim. Bizim protokolü mezotel monotabaka 8-16 ile over tümör hücre etkileşimleri analiz etmek için daha önce açıklanan yöntemlerden adapte edildi ve önce o over tümör hücreleri hariç teşvik etmek miyozin ve çekiş kuvveti bir integrin bağımlı aktivasyon kullanmak gösteren bir rapor açıklanmıştır bir tümör sfero 17 altından mezotel hücreleri. Bu model etkileşime zamansal ve mekansal bilgi sağlayarak, gerçek zamanlı iki hücre popülasyonlarının izlenmesi için time-lapse floresan mikroskobu yararlanır. Mezotel hücreleri yeşil floresan protein (GFP) ifade ederken yumurtalık kanseri hücreleri kırmızı floresan proteini (TÇ) ifade eder. TTT-ifade yumurtalık kanseri hücresi sferoidler GFP-ifade mezotel monolayer iliştirin. Sferoidler yayılması, işgal vekenara tek tabakalı bir delik oluştururken mezotel hücreleri zorlamak. Bu delik GFP görüntü negatif boşluk (siyah) olarak görüntülenmiştir. Delik alanı ardından nicel kontrolü ve yumurtalık kanseri ve / veya mezotel hücrelerinin deneysel popülasyonlar arasındaki boşluk aktivite farklılıkları analiz etmek için ölçülebilir. Bu test yumurtalık kanseri hücreleri (koşul başına sfero X 20-30 sferoidler başına 100), hücrelerin sadece az sayıda gerektirir, bu yüzden değerli primer tümör hücre numuneleri kullanılarak bu deney yapmak mümkündür. Dahası, bu tahlilde kolayca yüksek verimli tarama teknikleri için adapte edilebilir.
Burada sunulan "Mezotelyal Gümrükleme Assay" büyük mekansal ve zamansal ayrıntılı olarak, yumurtalık kanseri çok hücreli sferoidler ve mezotel hücre tek katmanlarının etkileşimleri izlemek için time-lapse mikroskop kullanır. Daha önce, 8-14 çeşitli gruplar olduğu yumurtalık kanseri hücrelerine tutunur ve mezotel hücre mono tabakaları içine işgal göstermek için son nokta deneyleri kullandı. Bu tahlil benzersiz olduğunu da bu iki hücre popülasyonlarının dinamiklerini …
The authors have nothing to disclose.
Biz Harvard Tıp Okulu'nda Nikon Görüntüleme Merkezi, özellikle Jennifer Waters, Lara Petrak ve Wendy Somon, eğitim ve timelapse mikroskopların kullanımı teşekkür etmek istiyorum. Biz de değerli tartışmalar için Rosa Ng ve Achim Besser teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe 5695837 (M. Iwanicki) ve JSB için GM064346 tarafından desteklenmiştir; Dr Miriam ve Sheldon Adelson G. Tıbbi Araştırma Vakfı (JSB için) bir hibe ile.
Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
Medium 199 | Gibco | 19950 | |
MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
Timelapse Microscope: | |||
Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
Vibration isolation table | TMC | ||
NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |