ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות
Summary
Assay אישור mesothelial המתוארת כאן מנצלת את התאים שכותרתו fluorescently ואת זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו להמחיש כמותית למדוד את יחסי הגומלין של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial. Assay מתווך זה מדגים את השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות.
Abstract
סרטן השחלות הוא הגורם המוביל של 5 מקרי מוות מסרטן הקשורים בארצות הברית 1. למרות התגובה הראשונית חיובית לטיפולים, 70 עד 90 אחוז של נשים עם סרטן השחלות מפתחים גרורות חדשות, הישנות הוא לעיתים קרובות קטלני 2. זהו, אם כן, יש צורך להבין כיצד גרורות משניים להתעורר על מנת לפתח טיפולים טובים יותר עבור סרטן השחלות ביניים ומאוחר הבמה. גרורות סרטן השחלות מתרחש כאשר תאים ממאירים להתנתק מאתר הגידול הראשוני ולהפיץ ברחבי חלל הצפק. התאים המופץ יכול ליצור אשכולות תאיים, או spheroids, כי יהיה גם להישאר פנויות, או שתל על איברים בתוך חלל הצפק 3 (איור 1, סרט 1).
כל האיברים בתוך חלל הצפק מכוסים שכבה אחת, רציפה של תאים mesothelial 4-6 (איור 2). עם זאת, תאים mesothelial נעדרים מתחתגידול המוני הצפק, כפי שעולה מחקרים מיקרוסקופ אלקטרונים של האדם חלקים הכרותות רקמת הגידול 3,5-7 (איור 2). הדבר מצביע על כך התאים mesothelial אינם נכללים תחת מסת הגידול על ידי תהליך לא ידוע.
קודם ניסויים במבחנה הראו כי תאים ראשוניים סרטן השחלות לצרף ביעילות רבה יותר את תאי מטריקס מאשר תאים mesothelial 8, ומחקרים מאוחרים יותר הראו כי תאים ראשוניים mesothelial הצפק למעשה לספק מחסום הידבקות בסרטן השחלות תאים ופלישה (לעומת הידבקות ופלישה על מצעים שלא כוסו עם תאים mesothelial) 9,10. זה מראה כי תאים mesothelial לפעול כמחסום נגד גרורות סרטן השחלות. המנגנונים תאית ומולקולרית שבו תאים סרטניים בשחלות לפרוץ את המחסום הזה, לא לכלול mesothelium יש, עד לאחרונה, נותר לא ידוע.
כאן אנו מתארים את ההמתודולוגיה של ה ב assay חוץ גופית, כי מודלים של אינטראקציה בין סרטן השחלות spheroids תאים תאים mesothelial in vivo (איור 3, סרט 2). פרוטוקול שלנו מותאמת השיטות שתוארו קודם לכן לניתוח סרטן השחלות תאים אינטראקציות עם monolayers mesothelial 8-16, ו תוארה לראשונה בשנת הדוח מראה כי תאים סרטניים בשחלות לנצל ההפעלה integrin תלוי של שרירן וכוח המתיחה על מנת לקדם את הוצאת תאים mesothelial מתחת 17 אליפטית הגידול. מודל זה מנצל את זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לעקוב אחר שתי אוכלוסיות תאים בזמן אמת, מתן מידע במרחב ובזמן על אינטראקציה. על תאים סרטניים בשחלות לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), בעוד התאים mesothelial לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). RFP-להביע את סרטן השחלות spheroids סלולריים לצרף monolayer GFP-להביע mesothelial. התפשטות spheroids, לפלוש, ולהכריח את התאים mesothelial בצד יצירת חור monolayer. חור זה דמיינו כחלל שלילי (שחור) בתמונה GFP. האזור של החור לאחר מכן ניתן למדוד כמותית כדי לנתח את ההבדלים בין פעילות אישור שליטה אוכלוסיות הניסוי של סרטן השחלות ו / או תאים mesothelial. Assay זה דורש רק מספר קטן של תאים סרטן השחלות (100 תאים לכל אליפטית צילומי 20-30 spheroids בכל מצב), אז זה אפשרי לבצע את assay באמצעות יקרות דגימות תאים סרטניים ראשוניים. יתר על כן, assay זה ניתן להתאים בקלות לסינון תפוקה גבוהה.
Protocol
Discussion
"Assay עמילות mesothelial" המובא כאן עושה שימוש זמן לשגות מיקרוסקופ כדי לעקוב אחר אינטראקציות של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial, בפירוט במרחב ובזמן רב. בעבר, מספר קבוצות 8-14 השתמשו מבחני נקודות קצה להראות כי תאים סרטניים בשחלות לצרף ולפלוש אל monolayers התא meso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות הדמיה Nikon מרכז בבית הספר לרפואה בהרווארד, במיוחד ג'ניפר ווטרס, לארה Petrak וסלמון וונדי, לאימונים השימוש של מיקרוסקופים timelapse שלהם. אנו רוצים גם להודות רוזה נג ו אחים בסר לדיונים חשובים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט 5695837 (למ 'Iwanicki) ו GM064346 כדי JSB, על ידי מענק מטעם ד"ר מרים ושלדון אדלסון למחקר רפואי קרן (כדי JSB).
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| 96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse Microscope: | |||
| Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |
References
- Jemal, A. . CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , (2007).
- Burleson, K. M. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
- Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).
- Zhang, X. Y. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Ksiazek, K. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).
- Heyman, L. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).
- Heyman, L. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502 .
- Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).
- Leroy-Dudal, J. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).
- Iwanicki, M. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
- Roberts, P. C. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
- Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).
- Brandt, B. 3D-extravasation model — selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).
- Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
- Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).
- Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).
