Summary
여기에서 우리는 액체 질소로 가득 Dewar 탱크에서 샘플 검색을 위해 저렴한 비용, 내구성 cryotolerant 장치를 제시. 건설 장비의 모듈식 설계의 용이성은 극저온 탱크에서 시료를 쓰는 과정이 안전하고 쉽습니다.
Abstract
액체 질소 (-196도 ℃) 액체 압력 하에서 보관 매우 춥고, 무취, 무색이다. 그것은 일반적으로 같은 혈액, 세포 및 조직의 1,2 등 생물 학적 물질의 장기 보관을위한 극저온 유체로 사용됩니다. 액체 질소 극저온 자연, 샘플 보존에 적합 반면, 문의에 대한 살아있는 조직의 급속한 동결을 일으킬 수 있습니다 - '극저온 화상'2로 알려진, 밀접하게 저장 및 Dewars에서 샘플 검색에 관련된 사람에 심한 동상으로 이어질 수 있습니다. 또한 액체 질소가 증발은 공기 중의 산소 농도를 줄이고, 특히 밀폐된 공간 2, 질식을 일으킬 수 있습니다.
실험실에서 생물 학적 샘플은 종종 Dewar 탱크 1 ~ 스테인레스 스틸 선반에 쌓인 cryovials 또는 cryoboxes에 저장됩니다. 이러한 스토리지 랙에은 랙에으로부터 줄어 드에서 박스를 방지하기 위해 긴 샤프트와 함께 하단에 제공됩니다루틴 처리시 Dewars. 모든 너무 자주, 그러나 귀중한 표본과 상자나 유리병 삐져 나올 액체 질소 채워 탱크의 바닥에 가라 앉다. 그러한 경우에는 샘플은 지루하고 여분의 용기 또는 폐기 그것에 액체 질소를 전송 후 검색할 수 있습니다. 상자와 유리병 후 비교적 안전하게 비우지 Dewar에서 회복 될 수 있습니다. 그러나, 액체 질소와 그 팽창 률의 극저온 자연 침몰한 샘플 회수 위험을 만듭니다. 이것은 일반적으로 시료 회수가 한 사람에 의해 실시 않을 것이 안전 기관에 의해 권장합니다. 또 다른 대안은 유리병 3 끄집어 상용 시원한 그래버이나 집게를 사용하는 것입니다. 그러나, 짙은 액체 충만 Dewars 내에서 제한된 가시들이 사용하는 주요 제한 포즈.
이 문서에서 우리는 안전하고 모두 극저온 유체를 포함하는 Dewar에서 샘플 검색을하게 Cryotolerant DIY 복구 장치의 건설을 설명기 쉬운.
Protocol
1. Cryoboxes의 검색을 위해 Cryotolerant 장치의 조립
- . 펜치를 사용하여, 3 양면 강한 넥타이 (그림 1A)하게 패 모양의 강한 타이 그림 1B에 표시된 참고 한쪽을 평탄케 : 강한 타이의 크기는 Dewar의 목의 직경에 따라 선택하실 수 있습니다 .
- . 그림 3 (AB)와 같이 Cryoscoop 기반을 형성 크라운 볼트 너트, 와셔 및 나사를 사용하여 강한 타이 T 스트랩 (그림 2) 참고 두 같은 강한 유대 관계를 확보 : 두 개의 강한 유대 관계는의 검색을 허용하는 데 사용됩니다 5 ½ 인치 × 5 ½ 인치 cryoboxes.
- 홈 붙이 플레이트 (그림 4)를 사용하여 홈 붙이 플레이트의 한쪽 끝을에 슬롯이 강한 넥타이 T 스트랩의 슬롯을 정렬하고 Hillman 너트와 볼트 (그림 5)의 도움으로 두 가지를 확보 참고 :. 경우 홈 붙이 플레이트와 강한 넥타이가 공동되지 않습니다내가 미리 뚫고 구멍으로, 당신은 구멍이 초경 드릴 비트를 사용 뚫고해야 할 것이다.
- 그림 6과 같이 펜치의 도움으로 홈 붙이 접시의 다른 쪽 끝을 구부려. (이 단계는 선택 사항입니다.)
- 때 액체 질소에서 그림 6과 같이 좋은 장비를 파악하기 위해 거품으로 핸들을 넣어. (선택 사항) 참고 : autoclaving 이전에 거품을 제거합니다.
2. Cryovials의 검색을 위해 Cryotolerant 장치의 조립
Cryotolerant DIY 복구 장치도 cryovials의 검색에 맞게 조정 할 수 있습니다. 이것은 액체 질소 (그림 7)에서 튜브를 떠서 위해 변조와 같이 스테인리스 스트레이너와 플랫베이스를 대체하는 것입니다.
- 나사가 빠지다 크라운 견과류와 홈 붙이 접시에 강한 타이 T 스트랩을 장착 볼트.
- 홈 붙이 접시에 스테인리스 스트레이너를 부착하기 전에 조심스럽게의 목을 구부., 이것은 쉽게 장치와 함께 작전을하게 스트레이너는 입술로 온다면, 입술을 아래로 구부 위해 펜치를 사용하여 레이 (그림 8) 참고 닮은 각도에서 동양 기지 펜치의 도움으로 거르는.
- 홈 붙이 접시 구멍과 함께 스트레이너의 손잡이에 구멍을 정렬하고 Hillman 견과류와 그림 8과 같이 볼트 도움 참고로 여과기를 확보 :. 스트레이너는 사전 뚫고 구멍으로 나오지 않으면, 당신이 필요합니다 초경 드릴 비트로 뚫고 구멍을 가지고 준비합니다.
3. Dewar에서 Cryoboxes 및 Cryovials 검색 중
- 시작하려면 극저온 장갑을 끼도록하고 안전한 공간을 허용하도록 Dewar에서 1 개 또는 2 개 냉장고 선반을 제거합니다.
- 부드럽게 강한 타이 T 스트랩베이스 (그림 5)를 들으며 직립 Cryotolerant DIY 복구 장치와 Dewar 하단 데리고 상자 falle를 수집즉시 따뜻한 물체와 접촉에 액체 질소 종기 질소 가스 (Leidenfrost 효과) 절연에 개체를 뒤덮었 :. Dewar 탱크주의의 하단으로 그렇죠. 샘플 회수하기 전에 장치를 냉각하기 위해 천천히 Dewar에 장치를 담가 액체 질소가 위의 단계를 진행하기 전에 충분히 장치를 냉각 수 있습니다.
- 항아리 밖으로 나가게 냉동고 상자와 약속 Dewar의 성벽을 따라 수직으로 장치를 당겨.
- Dewar의 바닥에서 가져온 상자를 잡아.
- cryovials를 검색하는 경우, 부드럽게 스트레이너 (그림 9)를 들으며 cryoscoop와 Dewar의 바닥을 다쳤어요.
- cryobox 검색과 마찬가지로 직립 장치를 끌어와 스트레이너에서 수집한 튜브를 잡아 야지.
4. 대표 결과
유전자 발현 연구의 주요 과제는 RNA의 품질은 저장 조건에 따라 다릅니다있다는 것입니다냉동 조직 샘플 및 RNA 추출 4. 그림 10 모두에 대해 총 RNA의 무결성에 대한 시료 처리의 효과가 나타납니다. 동일한 조직 소스 (인간 지방)에서 총 RNA는 다양한 샘플 처리를 받게되었다. 이전 실험, 손상 총 RNA 움직여 약 두배 18S rRNA 밴드 (그림 10, 레인 1)과 같은 강렬한 같은 28S rRNA 밴드가있는 명확 28S와 18S rRNA 밴드를 보여줍니다. 18S 강도 비율 2시 1분 5에서 출발 :이 2시 1분 비율 (28S : 18S)는 부분적으로 저하 RNA는 얼룩, 또는 28S로 나타나는 반면, RNA이 그대로 있다고 표시입니다. 3-4 차선이 상당한 저하와 RNA 샘플을 묘사. 이러한 RNA 샘플은 따라서 정기가 타락한 튜브와 상자의 검색 (그림 10, 레인 3-4의 필요성으로 인해 decanting와 장기 저장 장치를 모델링, Dewar (방법)에서 단기 retrievals에 의해 반복되는 부분 defreezing를 받게되었다 ). 그러나 샘플 Dewar 서비스에 저장DIY 장치 (방법 B)을 사용하지 않고, 따라서 어떠한 부분 defreezing, 그대로 RNA를 (그림 10, 레인 2)이 포함되어 있습니다.
1 그림. )베이스는 2 개의 3 양면의 강한 넥타이 표시된 치수로 구성되어 있습니다. 각 강력한 넥타이 하나의 큰 사전 뚫고 구멍 (고체 화살표) 및 각 얼굴에 여러 개의 작은 구멍 (작은 화살표)가 포함되어 있습니다. 이것은 너트와 볼트로 조임 허용하는 옵션을 제공합니다. 또한 작은 구멍 샘플 검색시 액체 질소의 빠른 배수를 허용합니다. B)에 강한 타이 각각의 한 측면은 L은 모양의 강한 넥타이 만드는 펜치의 도움으로 정리하고 있습니다.
그림 2. 강한 타이 T 스트랩이 함께 강한 유대 관계를 확보하는 데 사용됩니다. 강한 넥타이와 마찬가지로 T-스트랩 하나의 큰 사전 뚫고 구멍 (고체 화살표) 두 개의 작은 구멍 (smal 있습니다각 모서리에 '화살표). 너트와 볼트를 사용하여 스트랩 - 이것은 T의 길이를 따라 강한 유대 관계를 확보하실 수 있습니다. 또한 홈 붙이 접시에 T-스트랩을 고정 수 있습니다.
그림 3. ) 각 강한 넥타이) 나. 크라운 볼트 너트, 볼트와 와셔를 사용하여 길이를 따라, T-스트랩 중 한 코너로 고정되는 두 강한 유대은 5 ½ 인치 × 5 ½를 검색할 수 있도록 서로 인접 확보 cryoboxes 인치. X 2인치 등이 같은 작은 cryoboxes 들어,, 하나의 강한 넥타이는 T-스트랩없이 홈 붙이 판에 직접 고정 할 수 있습니다.
그림 4. 플랫 플레이트는 손잡이로 사용됩니다 끌어들 였는데. 홈 붙이 접시의 길이는 Dewar의 깊이에 따라 달라집니다. 이 경우에는 홈 붙이 플레이트 4 피트가 사용되었습니다. 홈 붙이 판재의 두께는 중요 s입니다Dewar을 가득 액체 질소에서 샘플을 검색하는 동안 얇은 홈 붙이 번호판 (<14 게이지) 장치가 어설픈하게 ince.
그림 5는. 강한 유대 관계와 T 스트랩으로 구성된 플랫베이스 그런 다음 홈 붙이 접시의 한쪽 끝에 고정합니다. T 스트랩의 남은 모서리에있는 큰 구멍은 평면 접시 슬롯과 정렬과 진수 볼트와 너트를 사용하여 고정한다. 이 장치는 현재 Dewar에서 cryoboxes를 검색하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 6. 홈 붙이 플랫 플레이트의 한쪽 끝을은 펜치를 사용하여 구부 러 특히 본 사건과 같이 깊은 Dewars을 위해 더 나은 손잡이를 제공하기 위해 거품으로 덮여있다.
그림 7. 와이어 메쉬와 스테인레스 스틸 손잡이와 스트레이너Dewar에서 cryovials를 검색하는 데 사용됩니다. 핸들 슬롯이 함께 제공되지 않은 경우 초경 비트와 드릴은 구멍을 뚫는 데 필요한 것입니다.
그림 8. cryovials의 검색을 쉽게하기 위해서는 스트레이너는 국자 모양의 스트레이너를 얻을 펜치를 사용하여 목을 따라 굽습니다. 스트레이너는이 사건에서와 같이 입술과 함께 제공되는 경우, 펜치는 그것을 구부하는 데 사용할 수 있습니다. 이 여과기는 Dewar 내에 잡히지 않길 보장합니다.
그림 9. 스트레이너는 16 진수 너트와 볼트를 사용하여 한쪽 끝에 홈 붙이 플랫 플레이트로 고정됩니다.
10 그림. 총 RNA의 샘플 무결성은 다른 시료 처리 조건에 노출. 탐구 RNA 품질이 C를 처리 샘플에 영향하는 방법onditions는 같은 소스로부터 RNA 샘플의 집합 handlings 두 가지 방법을 받게되었다. 방법 따라서 DIY 장치를 사용하여 샘플 retrievals를 받게 Dewar, 아니 일부 defreezing에서 RNA의 스토리지로 구성되어. 방법 B는 따라서 정기가 무너졌다 샘플을 가져오기위한 decanting와 장기 저장 장치를 모델링, Dewar에서 단기 retrievals에 의해 반복되는 부분 defreezing 들어서는 Dewar의 RNA의 스토리지로 구성되어. 총 RNA 무결성 후 겔 전기 영동에 의해 분석되었다. Lane1 : 샘플 전에 Dewar의 저장 공간, 레인 2 : 방법에 의해 검색 들어서는 Dewar의 샘플, 레인 3, 4 : 방법 B로 검색 들어서는 Dewar의 샘플, M : 100 BP의 사다리.
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Discussion
Dewar 탱크의 바닥에서 cryoboxes 및 cryovials를 검색하는 가장 일반적인 방법 중 하나는 여분의 용기에 액체 질소를 가만히 따르다하고 플라스크에 남아있는 또는 decanted 액체 질소에 떠 샘플을 끄집어하는 것입니다. 그러나 이것은 액체 질소 증기에 장시간 노출이에 의한 극저온 화상이나 질식의 원인이 될 수 있습니다 안전 연습이다. 타락한의 cryovials의 검색의 다른 일반적인 방법은 cryovial 집게 3의 사용을 포함한다. 그러나 액체 질소로 가득 탱크의 어두운 공간 내에서 제한된 가시는 기동성을 제한합니다.
위에서 설명한 Cryotolerant DIY 복구 장치는 제한된 시야와 깊은 flasks의 바닥에서 떨어진 cryoboxes 및 cryovials를 가져오기위한 저렴, 안전하고 쉬운 대안을 제공합니다. DIY 복구 장치를 취급의 용이성은 검색 이전 flasks을 비울 필요가 circumvents. 또한, RET의 도움 cryovial의 rieval는 장치가 하나의 개인이 집행될 수 있다고 말했다. 또한 DIY 복구 장치의 사용은 크게함으로써 시료 저장 조건에게 6,7를 개선, 동일한 유닛 주위 온도 하에서 지출에 저장되어있는 시간이 다른 시료의 양을 단축.
이러한 플라스틱, 탄소강 및 고무와 같은 많은 일반적으로 사용되는 재료는 액화 질소에 취성되고, 종종 스트레스 8,9,10하에 붕괴. DIY 장치에 사용되는 스테인리스 스틸 혹은 아연 도금 컴포넌트는 극저온 유체의 하위 동결 온도에서 손상 방지합니다. 또한, 이러한 구성 요소는 지역 철물점에서 이하 $ 50.00에 amounting DIY 장치의 건설과 저렴한 비용의 쉽게 사용할 수 있습니다. 긴 손잡이가 샘플 회복 중에 액체 질소 배출 인스턴트를 허용 극저온 유체와 다공베이스와 스트레이너와 직접 접촉에서 연산자를 방지하는 데 도움이됩니다. 급속한 Retrieval 샘플 검색 안전한 프로세스를 만드는 액체 질소 증기의 최소 노출 수 있습니다. 자사의 모듈형 설계로 인해 DIY 복구 장치 상자나 유리병 하나에 사용될 수있는 유연성을 가지고 있습니다. 또한, 디자인의 단순이 장치가 극저온 유체의 다른 유형에서 작동하도록 가능하게 모양과 크기를 변경 및 Dewars 맞게 수 있습니다. 이 장치의 사용은하지만, 평평한 바닥이없는 극저온 탱크의 경우 제한될 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
DIY 극저온 회수 장치 프로젝트 암 연구 프로그램, 과학 버지니아 학원에 메리 루이스 앤드류스 수상의 후원 "생물 정보학 및 분자 접근법을 사용하여 진핵 세포의 모델링 세균성 단백질 prenylation", "플라즈마에서 RNA 편집의 생리 의미의 과정에서 테스트되었습니다 토마스 F. Jeffress와 케이트 밀러 Jeffress 기념관 신뢰와 국가 계약 16.740.11.0364 (과학 교육부, 러시아)의 후원 돌기 세포. " 우리는 RNA 무결성 실험과 도움 베스 EOM 감사드립니다.
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