Summary
यहाँ हम देवर तरल नाइट्रोजन से भरा टैंक से नमूना पुनर्प्राप्ति के लिए एक कम लागत, टिकाऊ cryotolerant युक्ति उपस्थित थे. निर्माण और डिवाइस की मॉड्यूलर डिजाइन के आराम क्रायोजेनिक टैंक से नमूना पुनर्प्राप्ति की प्रक्रिया सुरक्षित और आसान बनाता है.
Abstract
तरल नाइट्रोजन बेरंग, बिना गंध, बहुत ठंड (-196 डिग्री सेल्सियस) तरल दबाव में रखा है. यह आमतौर पर रक्त कोशिकाओं और ऊतकों 1,2 के रूप में जैविक सामग्री की लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक क्रायोजेनिक तरल पदार्थ के रूप में प्रयोग किया जाता है. क्रायोजेनिक तरल नाइट्रोजन प्रकृति, जबकि नमूना संरक्षण के लिए आदर्श है, संपर्क पर जीवित ऊतकों की तेजी से ठंड का कारण बन सकते हैं - के रूप में क्रायोजेनिक जला 2 'में जाना जाता है, जो निकट Dewars से नमूने का भंडारण और पुनर्प्राप्ति में शामिल व्यक्तियों में गंभीर शीतदंश के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, के रूप में तरल नाइट्रोजन evaporates के यह हवा में ऑक्सीजन एकाग्रता कम कर देता है और श्वासावरोध सीमित दो रिक्त स्थान में विशेष रूप से, कारण हो सकता है.
प्रयोगशालाओं में, जैविक नमूने अक्सर cryovials या cryoboxes देवर के भीतर एक टैंक स्टेनलेस स्टील के रैक में खड़ी में जमा हो जाती है. इन भंडारण रैक एक लंबे समय के रैक से बाहर फिसल से रोकने के बक्से शाफ्ट के साथ और नीचे में प्रदान की जाती हैंदिनचर्या से निपटने के दौरान dewars. सब भी अक्सर, तथापि, बक्से या शीशियों कीमती नमूनों के साथ बाहर पर्ची और तरल नाइट्रोजन भरे टैंक के नीचे सिंक करने के लिए. ऐसे मामलों में, नमूने उबाते हुए एक अतिरिक्त कंटेनर या यह discarding में तरल नाइट्रोजन के हस्तांतरण के बाद लिया जा सकता है. बक्से और शीशियों तो अपेक्षाकृत सुरक्षित रूप से खाली देवर से बरामद हो सकता है. हालांकि, तरल नाइट्रोजन और इसके विस्तार की दर के क्रायोजेनिक प्रकृति के धँसा नमूना पुनर्प्राप्ति खतरनाक बनाता है. यह आमतौर पर सुरक्षा कार्यालय द्वारा सिफारिश की है कि नमूना पुनर्प्राप्ति बाहर एक ही व्यक्ति द्वारा किया जा कभी नहीं. एक अन्य विकल्प के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शांत grabbers या चिमटे का उपयोग करने के लिए 3 शीशियों खींच रहा है. हालांकि, अंधेरे तरल भरा Dewars के भीतर सीमित दृश्यता अपने प्रयोग में एक प्रमुख सीमा बन गया है.
इस अनुच्छेद में, हम एक Cryotolerant DIY पुनर्प्राप्ति उपकरण है, जो देवर से नमूना पुनर्प्राप्ति करता है क्रायोजेनिक तरल पदार्थ युक्त दोनों सुरक्षित एक के निर्माण का वर्णनआसान एन डी.
Protocol
1. Cryotolerant डिवाइस के Cryoboxes की पुनर्प्राप्ति के लिए विधानसभा
- . सरौता का प्रयोग, बाहर तीन पक्षीय मजबूत टाई करने के लिए (चित्रा 1 ए) एक एल आकार मजबूत टाई चित्रा 1 बी में दिखाया नोट के एक पक्ष को सीधा मजबूत टाई के आयाम देवर की गर्दन का व्यास के आधार पर चुना जा सकता है .
- दो में एक मजबूत टाई टी पट्टा (चित्रा 2) क्राउन बोल्ट, नट, वॉशर और पेंच का उपयोग करने के लिए Cryoscoop आधार के रूप में चित्रा 3 (एबी) के रूप में दिखाया गया नोट के साथ मजबूत संबंधों सुरक्षित: दो मजबूत संबंधों की पुनर्प्राप्ति की अनुमति देने के लिए उपयोग किया जाता है अंदर साढ़े 5 एक्स 5 आधा इंच cryoboxes.
- एक slotted प्लेट (चित्रा 4) का प्रयोग, slotted में थाली के एक छोर पर स्लॉट्स के साथ मजबूत टाई टी पट्टा पर स्लॉट्स और संरेखित दो Hillman नट और बोल्ट (चित्रा 5) की मदद से एक साथ सुरक्षित नोट: यदि slotted को थाली और मजबूत टाई नहीं सह हैमुझे पूर्व drilled छेद के साथ, आप छेद कार्बाइड ड्रिल बिट का उपयोग करने के लिए drilled है.
- सरौता की मदद से रखा थाली के दूसरे छोर मोड़ के रूप में 6 चित्र में दिखाया गया है. (यह कदम वैकल्पिक है).
- फोम के साथ संभाल लपेटो करने के लिए बेहतर समझ युक्ति तरल नाइट्रोजन में जब चित्रा 6 में दिखाया के रूप में. (वैकल्पिक) नोट: फोम वाष्पदावी विसंक्रण पहले निकालें.
2. Cryotolerant डिवाइस के Cryovials की पुनर्प्राप्ति के लिए विधानसभा
Cryotolerant DIY पुनर्प्राप्ति युक्ति भी cryovials की पुनर्प्राप्ति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह एक स्टेनलेस स्टील झरनी के साथ फ्लैट आधार प्रतिस्थापन के रूप में तरल नाइट्रोजन (चित्रा 7) से बाहर scooping शीशियों के लिए बदल दिया दिखाया शामिल है.
- खोलना क्राउन नट और बोल्ट slotted में थाली करने के लिए मजबूत टाई टी पट्टा संलग्न.
- Slotted में थाली करने के लिए स्टेनलेस स्टील छलनी संलग्न करने से पहले, धीरे से की गर्दन मोड़झरनी, यह आसान उपकरण के साथ एक निजी बनाना यदि छलनी होंठ के साथ आता है, चिमटा का उपयोग करने के लिए नीचे होंठ मोड़: सरौता के पूरबी एक कोण पर आधार करने के लिए (चित्रा 8) करछुल नोट सदृश करने के लिए मदद के साथ.
- झरनी के हैंडल पर रखा थाली पर छेद के साथ छेद संरेखित और Hillman नट और बोल्ट के रूप में 8 चित्र में दिखाया गया की मदद नोट के साथ झरनी सुरक्षित: अगर झरनी पूर्व drilled छेद के साथ नहीं आया है, आप की आवश्यकता होगी कार्बाइड ड्रिल बिट के साथ drilled छेद की व्यवस्था.
3. देवर से पुन: प्राप्त करने Cryoboxes और Cryovials
- शुरू करने के लिए, क्रायोजेनिक दस्ताने पर डाल दिया और दूर करने के लिए 1 या 2 देवर से फ्रीजर रैक चालों के लिए कमरे की अनुमति.
- धीरे ईमानदार Cryotolerant DIY पुनर्प्राप्ति मजबूत टाई टी पट्टा आधार (चित्रा 5) के साथ सुसज्जित डिवाइस के साथ देवर के नीचे के साथ परिमार्जन और बॉक्स falle इकट्ठातुरंत एक गर्म वस्तु के साथ संपर्क पर तरल नाइट्रोजन फोड़े, इन्सुलेट नाइट्रोजन गैस (Leidenfrost प्रभाव) में वस्तु घेर. देवर टैंक नोट के नीचे करने के लिए एन. नमूनों की पुनर्प्राप्ति करने के लिए डिवाइस से पहले शांत करने के लिए, धीरे डिवाइस देवर में विसर्जित कर दिया और तरल नाइट्रोजन डिवाइस शांत करने के लिए ऊपर कदम के साथ आगे बढ़ने से पहले पर्याप्त अनुमति देते हैं.
- युक्ति ईमानदार देवर की दीवारों के साथ टैंक से बाहर फ्रीजर बॉक्स स्कूप खींचो.
- देवर के नीचे से प्राप्त बॉक्स पकड़ो.
- Cryovials पुन: प्राप्त करने के लिए, धीरे से एक झरनी (9 चित्रा) के साथ फिट cryoscoop साथ देवर के नीचे परिमार्जन.
- Cryobox पुनर्प्राप्ति करने के लिए इसी प्रकार, इस डिवाइस ईमानदार खींचने के लिए और छलनी में एकत्र शीशियों हड़पने.
4. प्रतिनिधि परिणाम
जीन अभिव्यक्ति अध्ययनों में एक बड़ी चुनौती है कि शाही सेना की गुणवत्ता भंडारण की स्थिति पर निर्भर करता हैदोनों जमे हुए ऊतकों के नमूनों और चार शाही सेना निकाली. चित्रा 10 के लिए कुल शाही सेना की अखंडता पर नमूना से निपटने के प्रभाव को दर्शाता है. वही ऊतक स्रोत (मानव वसा) से कुल शाही सेना को अलग नमूना हैंडलिंग के अधीन था. प्रयोग करने के लिए पहले, बरकरार कुल शाही सेना preparate 28S rRNA बैंड के साथ स्पष्ट 28S और 18S rRNA बैंड 18S rRNA बैंड (10 चित्रा, लेन 1) के रूप में तीव्र के रूप में लगभग दो बार से पता चलता है. यह 2:1 के अनुपात (28S: 18S) एक संकेत है कि शाही सेना बरकरार है, जबकि आंशिक रूप से अपमानित शाही सेना एक धब्बा है, या अपने 28S के रूप में प्रकट होता है: 18S तीव्रता अनुपात 5 2:01 से रवाना. 3-4 लेन महत्वपूर्ण गिरावट के साथ शाही सेना के नमूने दर्शाया गया है. इन शाही सेना के नमूने देवर (विधि एक) से अल्पकालिक retrievals द्वारा दोहराया आंशिक defreezing के अधीन थे, इस प्रकार के आवधिक गिर शीशियों और बक्से (चित्र 10, लेन 3-4 की पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता के कारण decanting के साथ लंबी अवधि के भंडारण मॉडलिंग ). हालांकि, नमूनों देवर सेवित में संग्रहितDIY डिवाइस (विधि बी) का उपयोग कर, और इस प्रकार कोई आंशिक defreezing के बरकरार शाही सेना (10 चित्रा, लेन 2) होते हैं.
आकृति 1. ए) आधार दो तीन पक्षीय मजबूत टाई दिखाया आयाम होते हैं. प्रत्येक टाई - मजबूत एक बड़ी पूर्व drilled छेद (ठोस तीर) और हर चेहरे पर कई छोटे छेद (छोटे तीर) शामिल हैं. यह एक नट और बोल्ट के साथ बन्धन की अनुमति के लिए एक विकल्प प्रदान करता है. इसके अलावा छोटे छेद नमूना पुनर्प्राप्ति के दौरान तरल नाइट्रोजन का तेजी से जल निकासी की अनुमति बी) गठबंधन मजबूत प्रत्येक के एक तरफ सरौता की मदद करने के लिए एल आकार मजबूत टाई के साथ सीधा है.
चित्रा 2 मजबूत टाई टी पट्टा के साथ मजबूत संबंधों को सुरक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. मजबूत टाई की तरह, टी पट्टा एक बड़ी पूर्व drilled छेद (ठोस तीर) और दो छोटे छेद (smalएल) में ऐरो प्रत्येक कोने पर. नट और बोल्ट का उपयोग कर पट्टा - इस टी की लंबाई के साथ मजबूत संबंधों को हासिल करने की अनुमति देता है. यह भी रखा थाली टी पट्टा बन्धन में सक्षम बनाता है.
चित्रा 3. एक) प्रत्येक टाई - मजबूत टी पट्टा के एक कोने में fastened है, अपनी ताज बोल्ट नट, बोल्ट और वाशर का उपयोग लंबाई के साथ बी.) दो मजबूत संबंधों को एक दूसरे के निकट सुरक्षित हैं मदद करने के लिए 5 अंदर साढ़े 5 एक्स साढ़े पुनः प्राप्त cryoboxes अंदर. अंदर 2 एक्स 2 के रूप में छोटे cryoboxes के लिए अंदर, एक एक मजबूत टाई slotted में थाली करने के लिए सीधे एक टी पट्टा के बिना कर सकते हैं बांधा.
चित्रा 4. Slotted में फ्लैट प्लेट संभाल के रूप में प्रयोग किया जाता है. Slotted में प्लेट की लंबाई देवर की गहराई पर निर्भर करता है. इस मामले में, slotted में थाली की 4 फुट इस्तेमाल किया गया था. slotted में प्लेट की मोटाई के लिए महत्वपूर्ण है हैपतली रखा प्लेट (<14 गेज) इन्स युक्ति तार कर जबकि तरल नाइट्रोजन देवर भरा है से नमूनों को पुन: प्राप्त करने.
चित्रा 5 फ्लैट मजबूत संबंधों को और टी पट्टा से मिलकर आधार तो slotted में थाली के एक छोर पर सुरक्षित है. टी पट्टा के शेष कोने पर बड़ा छेद फ्लैट प्लेट पर स्लॉट के साथ गठबंधन किया है और हेक्स बोल्ट और अखरोट का उपयोग कर बांधा. अब इस डिवाइस के लिए देवर से cryoboxes को पुनः प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 6 slotted में फ्लैट प्लेट के एक छोर सरौता का उपयोग तुला हुआ है और फोम के साथ कवर गहरी Dewars, जैसा कि इस मामले में दिखाया के लिए विशेष रूप से बेहतर पकड़ प्रदान करते हैं.
7 चित्रा तार जाल और स्टेनलेस स्टील संभाल के साथ छलनी.है देवर से cryovials को वापस लाने के लिए किया है. यदि संभाल एक स्लॉट के साथ नहीं प्रदान की जाती है, कार्बाइड बिट के साथ ड्रिल एक छेद ड्रिलिंग के लिए आवश्यक हो जाएगा.
संख्या 8 cryovials की पुनर्प्राप्ति आसानी., झरनी सरौता का उपयोग करने के लिए करछुल आकार झरनी मिल गर्दन के साथ तुला हुआ है. यदि झरनी के रूप में इस मामले में होंठ के साथ प्रदान की जाती है, सरौता के लिए यह मोड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह सुनिश्चित करता है झरनी देवर के भीतर पकड़ा नहीं करता है.
9 चित्रा. छलनी अंत में एक slotted में फ्लैट प्लेट हेक्स नट और बोल्ट का उपयोग करने के लिए सुरक्षित है.
10 चित्रा. कुल शाही सेना का नमूना अखंडता अलग नमूना हैंडलिंग शर्तों के अधीन पता लगाने के लिए कैसे शाही सेना ग से निपटने नमूना गुणवत्ता से प्रभावित है.एक ही स्रोत से onditions, शाही सेना के नमूने का एक सेट handlings की दो विधियों के अधीन किया गया था. विधि नमूना retrievals DIY डिवाइस का उपयोग करने के लिए अधीन देवर, इस प्रकार कोई आंशिक defreezing नहीं में शाही सेना के भंडारण के शामिल. विधि बी देवर में शाही सेना के भंडारण देवर से अल्पकालिक retrievals द्वारा दोहराया आंशिक defreezing के अधीन है शामिल है, इस प्रकार गिर नमूने को पुन: प्राप्त करने के लिए आवधिक decanting के साथ लंबी अवधि के भंडारण मॉडलिंग. कुल शाही सेना अखंडता तो जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया था. Lane1: नमूना पहले देवर में भंडारण, 2 लेन: देवर से नमूना पद्धति A पुनर्प्राप्ति के अधीन, 3 लेन, 4: विधि बी द्वारा पुनर्प्राप्ति के अधीन देवर से नमूना, एम: 100 बीपी सीढ़ी.
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Discussion
एक देवर टैंक के नीचे से cryoboxes और cryovials पुन: प्राप्त करने का सबसे आम तरीकों में से एक खाली कंटेनर में तरल नाइट्रोजन छानना और बाहर खींच नमूने कुप्पी में शेष या में decanted तरल नाइट्रोजन चल रहा है. यह है, तथापि, एक असुरक्षित अभ्यास है कि क्रायोजेनिक जलता है या asphyxiation तरल नाइट्रोजन वाष्प के लिए लंबे समय तक निवेश 2 के लिए कारण का कारण हो सकता है. गिर cryovials की पुनर्प्राप्ति के अन्य आम तरीका cryovial 3 चिमटे का उपयोग शामिल है. हालांकि, तरल नाइट्रोजन से भरे टैंक के अंधेरे अंतरिक्ष के भीतर सीमित दृश्यता उनके गतिशीलता सीमित है.
Cryotolerant DIY पुनर्प्राप्ति उपकरण ऊपर वर्णित सीमित दृश्यता के साथ गहरे बोतल के नीचे से गिर cryoboxes और cryovials को पुन: प्राप्त करने के लिए एक सस्ता, सुरक्षित और आसान विकल्प प्रदान करता है. DIY पुनर्प्राप्ति डिवाइस से निपटने में आसानी पुनर्प्राप्ति से पहले बोतल खाली करने की आवश्यकता circumvents. इसके अलावा, भिगोरनाकी मदद से cryovial की rieval ने कहा कि डिवाइस एक ही व्यक्ति द्वारा किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, DIY पुनर्प्राप्ति डिवाइस का उपयोग काफी समय अन्य परिवेश तापमान के तहत खर्च एक ही इकाई में संग्रहीत नमूनों की राशि छोटा है, जिससे नमूना भंडारण की स्थिति 6,7 में सुधार.
प्लास्टिक, कार्बन स्टील और रबर जैसे कई सामग्री आमतौर पर इस्तेमाल किया तरल नाइट्रोजन में भंगुर हो जाते हैं, और अक्सर 8,9,10 तनाव के तहत अस्थिभंग. स्टेनलेस स्टील या जस्ती DIY डिवाइस में उपयोग घटकों के लिए क्रायोजेनिक तरल पदार्थ के उप ठंड तापमान से नुकसान के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. इसके अलावा, इन घटकों को स्थानीय हार्डवेयर की दुकानों और DIY कम से कम $ 50.00 के लिए राशि डिवाइस के निर्माण के साथ कम लागत में आसानी से उपलब्ध हैं. लंबी संभाल सीधा संपर्क क्रायोजेनिक तरल पदार्थ और छिद्रित आधार और छलनी से ऑपरेटर के साथ तुरंत अनुमति देते हैं नमूना वसूली के दौरान तरल नाइट्रोजन के draining को रोकने में मदद करता है. तेजी से आरetrieval तरल नाइट्रोजन वाष्प नमूना पुनर्प्राप्ति एक सुरक्षित प्रक्रिया बनाने के लिए न्यूनतम जोखिम की अनुमति देता है. अपनी मॉड्यूलर डिजाइन के कारण, DIY पुनर्प्राप्ति डिवाइस या तो बक्से या शीशियों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए लचीलापन है. इसके अलावा, डिजाइन की सादगी युक्ति आकृति और आकार बदलती और संभवतः क्रायोजेनिक तरल पदार्थ के अन्य प्रकार के साथ काम करने के Dewars के लिए अनुकूलित करने के लिए अनुमति देता है. इस उपकरण का उपयोग करते हैं, तथापि, कि एक फ्लैट नीचे नहीं है क्रायोजेनिक टैंक के मामले में हो सकता है सीमित हो.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
DIY क्रायोजेनिक पुनर्प्राप्ति युक्ति यूकेरियोटिक कोशिकाओं में जैव सूचना विज्ञान और आणविक दृष्टिकोण का उपयोग कर मॉडलिंग बैक्टीरियल प्रोटीन prenylation "कैंसर रिसर्च प्रोग्राम, वर्जीनिया विज्ञान अकादमी के लिए मरियम लुईस एंड्रयूज पुरस्कार द्वारा प्रायोजित," प्लाज्मा में शाही सेना संपादन की शारीरिक मतलब परियोजनाओं के पाठ्यक्रम में परीक्षण किया गया था वृक्ष के समान कोशिकाओं "थॉमस एफ Jeffress और केट मिलर Jeffress मेमोरियल ट्रस्ट और राज्य 16.740.11.0364 अनुबंध (विज्ञान और शिक्षा मंत्रालय, रूस) के द्वारा प्रायोजित. हम के बेथ EOM आरएनए अखंडता के प्रयोग के साथ सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
References
- Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. , Springer. 41 (1996).
- Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , Plenum Press. New York. (1996).
- Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , National Academies Press. (2011).
- Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
- Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).
- Crawford, R. J. Plastics Engineering. , Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
- Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. , University of New South Wales Press. (1996).
- Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. , (2003).
